人纤溶酶原K1-3区基因在大肠杆菌中的表达

将人纤溶酶原kringle 1- 3 (K1- 3)基因插入融合表达载体pET - 17b ,获得重组质粒pET -K13 ,转化E coliBL2 1(DE3) ,在IPTG诱导下 ,人纤溶酶原K1- 3基因在E coliBL2 1(DE3,pET -K13)中获得高效融合表达 ,表达量占菌体总蛋白的 2 4% ,表达产物以包涵体存在 ,Westernblot证明重组蛋白对人纤溶酶原抗血清有特异免疫原性 .

人纤溶酶原K1-3基因的克隆、表达和产物的纯化及抗癌活性分析

纤溶酶原K1 3功能区是近年发现的血管生成抑制因子 ,具有抑制肿瘤生长和转移的活性。以人血管生成抑制素cDNA为模板用PCR技术扩增了K1 3功能区的基因 ,DNA序列分析后克隆至质粒pPIC9K上获得重组质粒pPIC9K13,转化毕节酵母GS115 ,用PCR和G418法筛选高拷贝转化子 ,进行摇瓶发酵。SDS PAGE和Westernblot分析结果证实K1 3基因已在GS115分泌表达 ,并具有免疫活性。选用 30L和 80L罐进行高密度发酵 ,甲醇诱导 48h细胞密度达到OD2 5 0～ 30 0 ,比摇瓶提高 5～ 6倍 ,表达量 15 0 2 0 0mg L。发酵上清液经StreamlineSP离子交换及Phe nyl Sephorose疏水层析纯化 ,在SDS PAGE上显示一条带 ,纯度 96 % 。

人纤溶酶原K1-3基因的表达及抗肿瘤作用研究

目的:研究人纤溶酶原K1-3基因的原核表达及其产物K1-3蛋白的抗肿瘤活性。方法:构建含K1-3基因的表达载体pBV-K13;转化E.coliDH5α;热诱导表达菌株E.coliDH5α(pBV-K13)的K1-3基因表达;表达产物经溶解、复性和纯化后进行鸡胚绒毛尿囊膜(Chorioallantoic membrane,CAM)活性分析和小鼠B16黑色素瘤抑制实验。结果:SDS-PAGE和Western blot分析结果证实K1-3基因在大肠杆菌中获得高效表达,表达产物对人纤溶酶原抗血清具有特异免疫活性,并抑制CAM毛细血管生成及小鼠B16黑色素瘤生长。结论:原核表达的K1-3蛋白具有抑制血管生成和抗肿瘤作用。

脂质体介导人纤溶酶原k1-3基因诱导人肝癌细胞凋亡

目的观察脂质体介导人纤溶酶原k13基因诱导体外培养人肝癌细胞凋亡的效应。方法构建人纤溶酶原k13基因真核表达载体pcDNAk13并以阳离子脂质体介导pcDNAk13转染体外培养人肝癌细胞,经Heochst33258染色后,在荧光显微镜下观察细胞核的形态。结果转染pcDNAk13组可见致密浓染的凋亡细胞核。结论脂质体介导人纤溶酶原k13基因能诱导体外培养人肝癌细胞凋亡。

血管生成抑制素的功能结构域K1-3的融合表达与抗体制备

目的：重组表达angiostatin的功能结构域K1-3，并制备抗体，为其作用机理研究打下基础．方法：设计引物，通过PCR以人纤溶酶原CDNA为模板扩增出K1-3基因片段，克隆至pGEX-4T-l融合表达载体，IPTG诱导，挑出表达克隆，切下基因片段，克隆至pUC19进行序列测定，保留序列完全正确的克隆并进行诱导表达;从SDS-PAGEL切下表达的蛋白条带作为抗原免疫家兔，制备多克隆抗体，并以Westernblotting检测抗血清的结合特异性·结果：DNA电泳结果显示PCR扩增出约780hP的片段，序列测定表明为K1-3;K1-3可以与GST融合表达，产物存在于包含体中;抗血清与K1-3及煮沸变性的天然angiostatin特异地结合．结论：经PCR扩增并克隆到序列正确的K1-3片段，而且能够以融合形式表达，用其免疫家兔获得特异性抗体．

重组人纤溶酶原k1-3基因转染对血管内皮细胞的作用研究

目的观察脂质体介导人纤溶酶原k1-3基因转染人脐静脉内皮细胞导致细胞凋亡和移动抑制的效应,初步探讨k1-3基因的抗血管生成机制。方法以阳离子脂质体介导人纤溶酶原k1-3基因真核表达载体pcDNA-k13转染体外培养人脐静脉内皮细胞,经细胞凋亡检测和移动抑制试验,比较对照组和实验组的凋亡率和抑制率。结果转染pcDNA-k13组有明显的细胞凋亡效应和移动抑制。结论人纤溶酶原k1-3基因在人血管内皮细胞表达,并可能通过诱导细胞凋亡及抑制细胞迁移而抑制肿瘤新生血管的生成。

人血管抑素K1-3在毕赤酵母胞内表达的研究

目的:构建人血管抑素K1-3的重组酵母胞内表达质粒PH IL-D2/K1-3,获得重组目的蛋白。方法:从胎儿肝脏组织用RT-PCR方法扩增人血管抑素K1-3目的基因,克隆至酵母胞内表达质粒PH IL-D2中,线性化后转化到毕赤酵母GS115胞内,经PCR和Sourthern杂交筛选出阳性转化子,并用甲醇诱导表达。表达产物进行SDS-PAGE(12%)和W estern b lot检测,经赖氨酸亲和层析柱纯化后,用Lowry法测定蛋白含量,并进行生物活性测定。结果:SDS-PAGE和W estern b lot结果显示,表达蛋白质的相对分子量为30kd左右,低糖基化。Lowry法测定蛋白表达量为6.8mg/L。活性测定实验表明重组血管抑素能特异抑制人血管内皮细胞的增殖。结论:在毕赤酵母GS115胞内成功表达了人血管抑素K1-3重组蛋白。

重组人纤溶酶原K1-3蛋白的抗肿瘤活性研究

人纤溶酶原K1-3功能区是一个血管生成抑制因子。以人纤溶酶原k1-3基因在大肠杆菌中表达的重组K1-3蛋白进行鸡胚绒毛尿囊膜(chorioallantoicmembrane,CAM)血管生成抑制活性分析和小鼠B16黑色素瘤抑瘤实验,结果证实重组K1-3蛋白具有抑制毛细血管生成和抗肿瘤活性。

(K_(1,4);2)-图的3-闭包中的路

对(K1,4;2)-图,证明它的3-闭包的一个性质。G为{K1∨P5,T3}-free或K1∨P4-free的(K1,4;2)图,x,a,b为G中不同三点,x为G中局部3-连通的适宜点,G′由G在点x局部完备所得。若G′中有长为l的(a,b)-路,则G中有长为l的(a,b)-路。

原核表达的血管抑素K(1-3)蛋白对脑胶质瘤的生长抑制作用

目的 获得具有抗血管生成活性的angiostatinK(1 3) [AK(1 3) ]基因的原核表达蛋白 ,应用该蛋白治疗裸鼠皮下人脑胶质瘤 .方法 构建和鉴定pDH AK(1 3)载体并在大肠杆菌DH5α内表达 ,诱导后用SDS PAGE分析、经亲和层析纯化后行WesternBlot鉴定 ,以人脐带静脉血管内皮细胞抑制实验和鸡胚绒毛膜尿囊膜实验验证其生物学活性 ,应用AK (1 3)蛋白治疗裸鼠皮下人脑胶质瘤 .结果 获得抑制人脐带静脉血管内皮细胞生长活性的AK(1 3)原核表达蛋白 (Mr 为 35× 10 3) ,其蛋白总量占菌体总蛋白的 12 % ,该纯化表达蛋白 5mg·kg- 1 ·次 - 1 和 10mg·kg- 1 ·次- 1 组均可抑制裸鼠皮下人脑胶质瘤生长 ,抑瘤率分别为 34 5 %和 6 4 6 % .结论 该实验为应用抗血管生成药物治疗人脑胶质瘤等实体瘤研究奠定了初步基础 .

联合应用angiostatinK(1-3)和endostatin裸DNA对人脑胶质瘤生长的抑制作用

目的 :探讨联合应用angiostatinK(1 3) {ASK(1 3) }和endostatin(ES)裸DNA对人脑胶质瘤生长的影响和作用特点 .方法 :在 1 5只裸鼠皮下接种SHG4 4人脑胶质瘤细胞并分A ,B和C组 (n =5 ) ;在接种后第 1 2日 ,A组 :给予瘤体内注射 2 0 μL脂质体包裹的各 5 μg的 pcDNA S ASK (1 3)和pcDNA S ES质粒 ;B组 :瘤体内注射 2 0 μL脂质体包裹的 1 0μgpcDNA 3.1质粒 ;C组 :瘤体内注射 2 0 μL无菌生理盐水 ;3d后重复注射 1次 .每日定时观察肿瘤生长情况 .4 0d后处死裸鼠 ,检测和计算肿瘤体积、坏死率、血管数和抑瘤率 .结果 :A ,B和C组肿瘤的终体积分别是 4 .4 1 6± 1 .88cm3 ,8.0 34± 1 .85cm3 和 8.0 5 6± 1 .91cm3 ,A组抑瘤率为 4 6 .8% ;A ,B和C组肿瘤的平均坏死率分别为 39.1 2± 7.35 % ,9.1 7± 7.89%和 9.2 1± 7.4 8% ,A与B或C组比较差异显著 (P <0 .0 1 ) ,B ,C组比较差异不显著 (P >0 .0 5 ) .3组的血管计数分别为 3.92± 1 .89,1 1 .8± 2 .0 4和 1 2 .0± 2 .2 1 ,A与B或C组比较差异显著 (P <0 .0 1 ) ,B ,C组比较差异不显著 (P >0 .0 5 ) .结论 :联合应用ASK(1 3)和ES裸DNA可抑制胶质瘤的血管生成、导致其坏死增加 ,进而抑制肿瘤生长 .其作用机制有待深入研究 。

乳腺癌组织中ELMO3,FOXK1的表达及其临床意义

目的:检测乳腺癌组织中吞噬和运动蛋白3(engulfment and cell mobility 3,ELMO3)、叉头框转录因子1(forkhead box k1,FOXK1)的表达情况,并探讨两者在乳腺癌组织中表达的相关性及与乳腺癌患者临床病理参数、预后的关系。方法:收集2013年1月至2018年1月惠州市第三人民医院乳腺癌患者手术标本80例,应用实时荧光定量PCR(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)和免疫组织化学检测乳腺癌组织及癌旁组织中ELMO3与FOXK1的表达情况;并分析乳腺癌组织中ELMO3与FOXK1表达的相关性,及其的表达与乳腺癌患者临床病理参数、预后的关系。结果:qRT-PCR检测ELMO3mRNA,FOXK1mRNA在乳腺癌组织中表达分别为1.16±0.48,1.34±0.60,在癌旁组织中表达分别为0.81±0.36,0.95±0.49;乳腺癌组织中ELMO3与FOXK1表达水平均高于癌旁组织(均P<0.05),且乳腺癌组织中ELMO3与FOXK1的表达呈正相关(r=0.423,P=0.037)。免疫组织化学检测EL MO3与FOX K1在乳腺癌组织中阳性表达分别为58例(72.52%),6 2例(7 7. 5 0%),在癌旁组织中阳性表达分别为2 8例(3 5. 0 0%), 2 9例(3 6. 2 5%),乳腺癌组织中ELMO3与FOXK1阳性表达率均高于癌旁组织(均P<0.05)。ELMO3与肿瘤TNM分期、淋巴结转移显著相关,FOXK1与肿瘤组织TNM分期、淋巴结转移和组织分级显著相关(均P<0.05)。KaplanMeier生存曲线分析显示乳腺癌组织中ELMO3与FOXK1高表达患者生存期较短。结论:乳腺癌组织中ELMO3与FOXK1呈高表达,并与肿瘤发生发展及预后有关。ELMO3与FOXK1在乳腺癌组织中表达呈正相关,可能协同参与了乳腺癌的发生发展。ELMO3与FOXK1具有作为乳腺癌新的标志物、治疗靶标及评估预后的潜在价值。

NBT-KBT-BT三元系无铅压电陶瓷的研究进展

从准同型相界、压电活性、退极化温度和掺杂改性等方面,综述了NBT-KBT-BT三元系无铅压电陶瓷的最新进展,对其发展进行了展望。研究表明,三方的NBT和四方的KBT-BT之间存在准晶相界,准晶相界附近的组分具有高压电性能,而四方相区的组分具有高的退极化温度。今后的研究重点将集中于A位或B位取代对NBT-KBT-BT体系的压电性能和退极化行为的作用,三元系陶瓷粉体烧结活性的提高以及新型陶瓷制备技术,如晶粒定向陶瓷制备工艺等。

KNNS-BNKZ无铅压电陶瓷的制备及其电性能研究

采用传统固相法中的直接合成法和两步合成法制备了0.96(K_0.48Na_0.52)(Nb_1-x_Sb_x)O_3-0.04(Na_0.82K_0.18)_0.5Bi_0.5ZrO_3(KNNS-BNKZ)无铅压电陶瓷,研究了(Bi,Na,K)ZrO_3添加方式,以及Sb摩尔分数对KNNSBNKZ材料显微组织结构和电性能的影响规律。结果表明,采用直接合成法得到的KNNS-BNKZ陶瓷在室温下为四方相,而采用两步合成法得到的陶瓷在室温下为正交-四方两相共存,且随着Sb摩尔分数的增加,陶瓷材料的密度增大,室温下的相对介电常数增大,压电常数增大,居里温度降低。采用两步合成法制备的Sb摩尔分数为0.06的KNNS-BNKZ陶瓷具有最佳电性能:室温下,相对介电常数εr=1 659,介电损耗tanδ=0.038,居里温度T_C=243℃,压电常数d_33=138pC/N。

大黄素及联合阿帕替尼对人甲状腺癌细胞K1抑制作用的实验研究

目的:探讨大黄素及联合阿帕替尼对人甲状腺癌细胞K1的抑制作用及其机制。方法:细胞分组:空白组(PBS)、大黄素组(100μmol/L)、阿帕替尼组(10μmol/L)、联合组(100μmol/L大黄素+10μmol/L阿帕替尼),不同给药时间后,CCK-8法检测细胞增殖活性,划痕实验和Transwell法检测细胞迁移和侵袭能力,流式细胞仪检测细胞凋亡率,Western blotting检测Bax(促凋亡蛋白)、Bcl-2(抗凋亡蛋白)、Caspase-3(半胱氨酸蛋白酶-3)及VEGFR-2(血管内皮生长因子受体-2)蛋白表达。建立人甲状腺癌细胞K1裸鼠移植模型,分为模型组、大黄素组(10 mg/kg)、阿帕替尼组(100 mg/kg)、联合组(10 mg/kg大黄素+100 mg/kg阿帕替尼),分组给药,每日2次,连续给药28 d,观察对肿瘤生长的影响。结果:大黄素组、阿帕替尼组和联合组的细胞存活率、凋亡率、细胞迁移和侵袭个数及Bcl-2及VEGFR-2蛋白表达均低于空白组,大黄素组、阿帕替尼组和联合组的Bax、Caspase-3表达均高于空白组;均有统计学差异(P<0.05,P<0.01)。大黄素组、阿帕替尼组和联合组对瘤体的抑制率均显著高于模型组,均有统计学差异(P<0.05,P<0.01)。联合组上述变化最为显著。结论:大黄素和阿帕替尼对人甲状腺癌细胞K1细胞的生长均具有明显的抑制作用,大黄素联合阿帕替尼后效果更为显著,可能与调节Bax/Bcl-2平衡,激活Caspase-3表达和抑制VEGFR-2的表达并诱导凋亡有关。

Angiostatin K(1-3)基因的原核表达和蛋白活性测定

目的 获得angiostatinK(1 3)基因的原核表达蛋白 ,检测其活性。方法 构建和鉴定pBV2 2 0 AK(1 3)载体并在大肠杆菌DH5α内表达 ,诱导后用SDS PAGE分析、经亲和层析纯化后行WesternBlot鉴定 ,以牛微血管内皮细胞抑制实验和鸡胚绒毛膜尿囊膜实验验证其生物学活性。结果 获得抑制牛微血管内皮细胞生长活性的angiostatinK(1 3)原核表达蛋白 ,其蛋白重量占菌体总蛋白的 7%。

一类完全三部图的K_(1,3)-因子大集

令G是一个有限图,H是G的一个子图.若V(H)=V(G),则称H为G的生成子图.图G的一个λ重F-因子,记为Sλ(F,G),是G的一个生成子图且可分拆为若干与F同构的子图(称为F-区组)的并,使得V(G)中的每一个顶点恰出现在λ个F-区组中.一个图G的λ重F-因子大集,记为LSλ(F G),是G中所有与F同构的子图的一个分拆{B_i}_i,使得每个B_i均构成一个Sλ(F,G).当λ=1时,λ可省略不写.本文中,我们证明了当v≡4 mod 24时,存在LS(K1,3,Kv,v,v).

桑叶调节PI3K/Akt/PPARα/CPT-1通路改善2型糖尿病大鼠肝脏糖脂代谢紊乱机制

目的:基于磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B/过氧化物酶体增殖物激活受体α/肉毒碱棕榈酰基转移酶-1(PI3K/Akt/PPARα/CPT-1)信号通路探讨桑叶水提物对2型糖尿病(T2DM)大鼠肝脏糖脂代谢紊乱的作用及其机制。方法:高脂喂养联合腹腔注射链脲佐菌素(STZ)方法制备T2DM模型,按血糖、体质量将造模成功大鼠随机分为模型组、二甲双胍(0.2 g·kg^(-1))组和桑叶水提物(含生药4.0 g·kg^(-1))组,连续给药8周,每周相同时间测定空腹血糖。苏木素-伊红(HE)染色、油红O染色观察肝脏组织形态学和脂肪变化;生化分析法测定血清总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天冬氨基酸氨基转移酶(AST)水平;蛋白免疫印迹法(Western blot)检测肝脏磷酸化磷脂酰肌醇3-激酶(p-PI3K)、PI3K、磷酸化蛋白激酶B(p-Akt)、Akt、PPAR-α、CPT-1蛋白表达。结果:给药8周后,与正常组比较,模型组大鼠血糖显著升高(P<0.01);与模型组比较,桑叶水提物组大鼠血糖显著降低(P<0.01)。HE染色显示,正常组大鼠肝组织结构完整,肝细胞以中央静脉为中心呈放射状排列;模型组大鼠肝细胞损伤明显;与模型组比较,桑叶水提物组大鼠空泡变性程度显著降低,未见小胆管增生等病变。油红O染色显示,正常组大鼠肝细胞无明显脂肪变性、坏死,肝细胞几乎无脂滴;模型组大鼠肝内脂滴较正常组明显增加;桑叶给药可明显减少大鼠肝脏脂滴。模型组大鼠TC、TG、LDL-C、AST、ALT水平较正常组显著升高(P<0.01);桑叶水提物组大鼠TC、TG、LDL-C、AST、ALT水平较模型组明显降低(P<0.05,P<0.01)。Western blot结果显示,与正常组比较,模型组大鼠p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、PPARα和CPT-1的蛋白表达显著降低(P<0.01);与模型组比较,桑叶水提物能明显增加p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、PPARα和CPT-1的蛋白表达(P<0.05,P<0.01)。结论:桑叶水提物可改善T2DM大鼠肝脏糖代谢紊乱,降糖机制可能与调控PI3K/Akt/PPAR-α/CPT-1信号通路有关。

化痰通脉饮对多囊卵巢综合征大鼠IRS-1-PI3K/Akt及NF-κB信号串流的影响

目的:观察化痰通脉饮对多囊卵巢综合征(PCOS)大鼠模型胰岛素受体底-1-磷脂酰肌醇-3激酶(IRS-1-PI3K)/丝苏氨酸蛋白激酶(Akt)及核转录因子-κB(NF-κB)信号串流的影响,为中药复方多靶点多通路作用起效模式的论证提供科学的依据,为治疗PCOS开辟新的思路。方法:将大鼠分为正常组、模型组、二甲双胍组(二甲双胍0. 16 g·kg-1·d-1)和化痰通脉饮低、中、高剂量组(8,16,24 g·kg-1·d-1),每组8只,利用“胰岛素(INS)联合绒毛膜促性腺激素(HCG)诱导大鼠PCOS模型”方案对非正常组大鼠进行造模,完成后采用蛋白免疫印迹法(Western blot)及酶联免疫吸附试验(ELISA)检测各组大鼠肝脏中IRS-1,PI3K,Akt,NF-κB p65,NF-κB抑制蛋白(IκB)等蛋白表达和血清中肿瘤坏死因子-α(TNF-α),白细胞介素-1β(IL-1β)的变化。结果:与正常组比较,模型组肝脏中IRS-1,Akt,PI3K,IκB蛋白表达明显降低(P <0. 05),NF-κB p65蛋白的表达明显升高(P <0. 05);与模型组比较,化痰通脉饮高剂量组大鼠的肝脏中IRS-1,Akt,PI3K,IκB蛋白表达明显升高(P <0. 05),NF-κB p65蛋白表达明显降低(P <0. 05)。模型组大鼠血清中TNF-α,IL-1β水平较正常组明显升高(P <0. 05);化痰通脉饮低、中、高剂量组大鼠血清中TNF-α,IL-1β水平较模型组明显降低(P <0. 05)。结论:PCOS发病过程中IRS-1-PI3K/Akt与NF-κB通路有交叉作用,化痰通脉饮对涉及的IRS-1-PI3K/Akt与NF-κB通路异常均有较好的回调作用。