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KSHV K15P及其突变体的慢病毒包装与稳定细胞株的筛选及其对内皮细胞增殖迁移的影响
被引量:
1
1
作者
周畅
许常青
+5 位作者
许方玮
方圆
陈伟
文志
林康
王林定
《安徽医科大学学报》
CAS
北大核心
2019年第11期1765-1770,共6页
目的包装包含卡波肉瘤相关疱疹病毒(KSHV)K15P及其突变体K15P(YF)基因的慢病毒颗粒,并对此基因在EA.hy926细胞内稳定表达进行研究。方法通过PCR方法扩增获得KSHV K15P、K15P(YF)基因片段,使用限制性内切酶Not I与BamH I酶切和TA克隆法构...
目的包装包含卡波肉瘤相关疱疹病毒(KSHV)K15P及其突变体K15P(YF)基因的慢病毒颗粒,并对此基因在EA.hy926细胞内稳定表达进行研究。方法通过PCR方法扩增获得KSHV K15P、K15P(YF)基因片段,使用限制性内切酶Not I与BamH I酶切和TA克隆法构建T载体与慢病毒表达载体pHAGE-CMV-MCS-K15P-Puro、pHAGE-CMV-MCS-K15P(YF)-Puro,通过lip2000将构建好的慢病毒表达载体与两种辅助包装质粒PSPAX2和pMD2.g共转染HEK 293T细胞,48 h后收集慢病毒。慢病毒感染EA.hy926细胞并通过嘌呤霉素筛选稳定表达株,Western blot检测K15P与K15P(YF)蛋白的表达。Transwell与CCK8实验检测K15P对内皮细胞的增殖迁移影响。结果成功构建慢病毒表达载体,筛选出稳定表达K15P、K15P(YF)蛋白的EA.hy926细胞。在EA.hy926细胞Transwell迁移实验中,与空载体组和K15P突变体组(0.98±0.23)比较,K15P组(2.25±0.15)的EA.hy926细胞的迁移能力明显增强(P<0.01),三组细胞迁移量差异有统计学意义(F=113.5,P<0.01);CCK8增殖活性实验中,与空载体组和K15P(YF)组(109.23±12.58)比较,K15P组(138.69±7.47)的EA.hy926细胞的增殖能力明显增强(P<0.01),三组细胞增殖活性差异有统计学意义(F=40.78,P<0.01)。结论K15P蛋白增强了内皮细胞的增殖与迁移,而K15P(YF)突变体的促进细胞增殖迁移能力减弱,提示K15P蛋白可能在KS的发生发展中参与重要作用。
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关键词
卡波肉瘤相关疱疹病毒
k15p
k15p
(YF)
慢病毒
EA.hy926
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职称材料
KSHV K15P慢病毒载体的构建及其滴度测定
被引量:
1
2
作者
许常青
陈伟
+2 位作者
方圆
汪小五
王林定
《安徽医科大学学报》
CAS
北大核心
2016年第10期1417-1420,共4页
目的构建含卡波肉瘤相关疱疹病毒(KSHV)ORF K15P基因的慢病毒载体,并对其在293T细胞内的表达进行研究。方法 PCR法扩增获得KSHV K15P基因,限制性内切酶Nhe I酶切和无缝克隆法构建重组慢病毒载体p CDHCMV-K15P-GFP,通过脂质体转染试剂将...
目的构建含卡波肉瘤相关疱疹病毒(KSHV)ORF K15P基因的慢病毒载体,并对其在293T细胞内的表达进行研究。方法 PCR法扩增获得KSHV K15P基因,限制性内切酶Nhe I酶切和无缝克隆法构建重组慢病毒载体p CDHCMV-K15P-GFP,通过脂质体转染试剂将重组慢病毒载体与3种辅助质粒p MDL-PRRE、pRSV-Rev和p MD2.g共转染HEK 293T细胞包装产生慢病毒,Western blot法检测K15P蛋白的表达。结果经酶切及测序鉴定,成功构建慢病毒载体,重组慢病毒质粒与辅助质粒共转染HEK 293T细胞可见有荧光表达,说明K15P基因在细胞内有表达并且96 h后产生4×106TU/ml滴度为慢病毒。结论成功构建了KSHV K15P慢病毒表达载体p CDH-CMV-K15P-GFP,获得高效表达K15P基因的慢病毒颗粒,为后续其在细胞内的功能研究奠定实验基础。
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关键词
卡波肉瘤相关疱疹病毒
k15p
基因
慢病毒
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职称材料
KSHV K15蛋白多克隆抗体的制备及其初步鉴定
3
作者
陈伟
方圆
+5 位作者
汪小五
许常青
朱晨辰
杨宇
张龙龙
王林定
《安徽医科大学学报》
CAS
北大核心
2016年第1期1-4,共4页
目的制备卡波氏肉瘤相关疱疹病毒(KSHV)K15蛋白多克隆抗体,并将其应用于细胞内K15蛋白的检测。方法选择K15基因第8个外显子(K15P_(ex8))序列做为模板,构建K15P_(ex8)的表达载体p QE-80L-K15P_(ex8)。诱导重组菌蛋白表达,免疫新西兰兔,...
目的制备卡波氏肉瘤相关疱疹病毒(KSHV)K15蛋白多克隆抗体,并将其应用于细胞内K15蛋白的检测。方法选择K15基因第8个外显子(K15P_(ex8))序列做为模板,构建K15P_(ex8)的表达载体p QE-80L-K15P_(ex8)。诱导重组菌蛋白表达,免疫新西兰兔,制备抗K15P_(ex8)多克隆抗体,并用间接ELISA法测定抗体效价。将p FJ和p FJ-K15P两种重组质粒分别转入HEK 293T细胞,用Western blot法检测抗K15P_(ex8)多克隆抗体对K15P-Flag蛋白的识别。结果由K15P_(ex8)制备的抗K15P_(ex8)多克隆抗体效价大于1∶6 400,能特异性识别重组质粒p FJ-K15P转染293T细胞产生的K15P-Flag融合蛋白。结论初步证明K15P_(ex8)蛋白有免疫反应性,该多克隆抗体可用于重组的K15P-Flag融合蛋白的检测。
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关键词
卡波氏肉瘤相关疱疹病毒
K15基因
多克隆抗体
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职称材料
题名
KSHV K15P及其突变体的慢病毒包装与稳定细胞株的筛选及其对内皮细胞增殖迁移的影响
被引量:
1
1
作者
周畅
许常青
许方玮
方圆
陈伟
文志
林康
王林定
机构
安徽医科大学微生物学教研室
国际关系学院英语系
出处
《安徽医科大学学报》
CAS
北大核心
2019年第11期1765-1770,共6页
基金
国家自然科学基金(编号:81271837)
安徽高校自然科学研究项目(编号:KJ2012A161)
安徽省自然科学基金(编号:1708085MH193)
文摘
目的包装包含卡波肉瘤相关疱疹病毒(KSHV)K15P及其突变体K15P(YF)基因的慢病毒颗粒,并对此基因在EA.hy926细胞内稳定表达进行研究。方法通过PCR方法扩增获得KSHV K15P、K15P(YF)基因片段,使用限制性内切酶Not I与BamH I酶切和TA克隆法构建T载体与慢病毒表达载体pHAGE-CMV-MCS-K15P-Puro、pHAGE-CMV-MCS-K15P(YF)-Puro,通过lip2000将构建好的慢病毒表达载体与两种辅助包装质粒PSPAX2和pMD2.g共转染HEK 293T细胞,48 h后收集慢病毒。慢病毒感染EA.hy926细胞并通过嘌呤霉素筛选稳定表达株,Western blot检测K15P与K15P(YF)蛋白的表达。Transwell与CCK8实验检测K15P对内皮细胞的增殖迁移影响。结果成功构建慢病毒表达载体,筛选出稳定表达K15P、K15P(YF)蛋白的EA.hy926细胞。在EA.hy926细胞Transwell迁移实验中,与空载体组和K15P突变体组(0.98±0.23)比较,K15P组(2.25±0.15)的EA.hy926细胞的迁移能力明显增强(P<0.01),三组细胞迁移量差异有统计学意义(F=113.5,P<0.01);CCK8增殖活性实验中,与空载体组和K15P(YF)组(109.23±12.58)比较,K15P组(138.69±7.47)的EA.hy926细胞的增殖能力明显增强(P<0.01),三组细胞增殖活性差异有统计学意义(F=40.78,P<0.01)。结论K15P蛋白增强了内皮细胞的增殖与迁移,而K15P(YF)突变体的促进细胞增殖迁移能力减弱,提示K15P蛋白可能在KS的发生发展中参与重要作用。
关键词
卡波肉瘤相关疱疹病毒
k15p
k15p
(YF)
慢病毒
EA.hy926
Keywords
Kapos sarcoma-associated herpesvirus
k15p
k15p
(YF)
lentivirus
EA.hy926
分类号
R394.3 [医药卫生—医学遗传学]
R373.9 [医药卫生—病原生物学]
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职称材料
题名
KSHV K15P慢病毒载体的构建及其滴度测定
被引量:
1
2
作者
许常青
陈伟
方圆
汪小五
王林定
机构
安徽医科大学微生物学教研室
合肥市第三人民医院检验科
出处
《安徽医科大学学报》
CAS
北大核心
2016年第10期1417-1420,共4页
基金
国家自然科学基金(编号:81271837)
安徽省高校省级科学研究项目(编号:KJ2012A161)
安徽医科大学博士科研经费资助项目(编号:XJ200914)
文摘
目的构建含卡波肉瘤相关疱疹病毒(KSHV)ORF K15P基因的慢病毒载体,并对其在293T细胞内的表达进行研究。方法 PCR法扩增获得KSHV K15P基因,限制性内切酶Nhe I酶切和无缝克隆法构建重组慢病毒载体p CDHCMV-K15P-GFP,通过脂质体转染试剂将重组慢病毒载体与3种辅助质粒p MDL-PRRE、pRSV-Rev和p MD2.g共转染HEK 293T细胞包装产生慢病毒,Western blot法检测K15P蛋白的表达。结果经酶切及测序鉴定,成功构建慢病毒载体,重组慢病毒质粒与辅助质粒共转染HEK 293T细胞可见有荧光表达,说明K15P基因在细胞内有表达并且96 h后产生4×106TU/ml滴度为慢病毒。结论成功构建了KSHV K15P慢病毒表达载体p CDH-CMV-K15P-GFP,获得高效表达K15P基因的慢病毒颗粒,为后续其在细胞内的功能研究奠定实验基础。
关键词
卡波肉瘤相关疱疹病毒
k15p
基因
慢病毒
Keywords
Kaposi sarcoma-associated herpesvirus
k15p
gene
lentivirus
分类号
R394.3 [医药卫生—医学遗传学]
R373.9 [医药卫生—病原生物学]
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职称材料
题名
KSHV K15蛋白多克隆抗体的制备及其初步鉴定
3
作者
陈伟
方圆
汪小五
许常青
朱晨辰
杨宇
张龙龙
王林定
机构
安徽医科大学微生物学教研室
出处
《安徽医科大学学报》
CAS
北大核心
2016年第1期1-4,共4页
基金
国家自然科学基金(编号:81271837)
安徽高校省级自然科学研究项目(编号:KJ2012A161)
安徽医科大学博士科研经费资助项目(编号:XJ200914)
文摘
目的制备卡波氏肉瘤相关疱疹病毒(KSHV)K15蛋白多克隆抗体,并将其应用于细胞内K15蛋白的检测。方法选择K15基因第8个外显子(K15P_(ex8))序列做为模板,构建K15P_(ex8)的表达载体p QE-80L-K15P_(ex8)。诱导重组菌蛋白表达,免疫新西兰兔,制备抗K15P_(ex8)多克隆抗体,并用间接ELISA法测定抗体效价。将p FJ和p FJ-K15P两种重组质粒分别转入HEK 293T细胞,用Western blot法检测抗K15P_(ex8)多克隆抗体对K15P-Flag蛋白的识别。结果由K15P_(ex8)制备的抗K15P_(ex8)多克隆抗体效价大于1∶6 400,能特异性识别重组质粒p FJ-K15P转染293T细胞产生的K15P-Flag融合蛋白。结论初步证明K15P_(ex8)蛋白有免疫反应性,该多克隆抗体可用于重组的K15P-Flag融合蛋白的检测。
关键词
卡波氏肉瘤相关疱疹病毒
K15基因
多克隆抗体
Keywords
Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus
k15p
gene
polyclonal antibody
分类号
R373.4 [医药卫生—病原生物学]
下载PDF
职称材料
题名
作者
出处
发文年
被引量
操作
1
KSHV K15P及其突变体的慢病毒包装与稳定细胞株的筛选及其对内皮细胞增殖迁移的影响
周畅
许常青
许方玮
方圆
陈伟
文志
林康
王林定
《安徽医科大学学报》
CAS
北大核心
2019
1
下载PDF
职称材料
2
KSHV K15P慢病毒载体的构建及其滴度测定
许常青
陈伟
方圆
汪小五
王林定
《安徽医科大学学报》
CAS
北大核心
2016
1
下载PDF
职称材料
3
KSHV K15蛋白多克隆抗体的制备及其初步鉴定
陈伟
方圆
汪小五
许常青
朱晨辰
杨宇
张龙龙
王林定
《安徽医科大学学报》
CAS
北大核心
2016
0
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职称材料
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