非洲猪瘟病毒K196R基因实时荧光定量PCR检测方法的建立

为建立一种准确、特异、高效、快速的非洲猪瘟病毒定量检测方法,本研究根据非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)早期表达基因K196R的基因序列,设计了TaqMan荧光定量PCR引物及探针,通过优化退火温度、引物及探针浓度,建立了快速检测ASFV的TaqMan荧光定量PCR检测方法。结果表明,该方法选择的引物具有高度灵敏性和特异性,以构建的重组质粒为标准品建立的TaqMan荧光定量PCR方法的标准曲线具有良好的线性关系(R2=0.998),对ASFV核酸最低检测下限为1.3拷贝,且与猪伪狂犬病病毒、猪细小病毒、猪圆环病毒2型等多种病原不存在交叉反应。本研究建立的K196R基因实时荧光定量PCR检测方法为非洲猪瘟疫情提供了一种新型、灵敏和特异的早期检测方法。

非洲猪瘟病毒K196R和A240L蛋白的可溶性表达及酶活力分析

旨在提供可用候选抗原蛋白,用于非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)的诊断及免疫预防研究。将ASFV SY18株K196R和A240L蛋白的编码基因进行密码子优化,并在其N端添加促溶标签进行融合表达;TEV酶切后利用亲和层析纯化目的蛋白,并通过Western blot和酶活检测试剂盒对其反应性和体外酶活力进行鉴定。结果显示,K196R和A240L蛋白分别通过添加SUMO和MBP标签实现了可溶性表达,标签去除后蛋白大小分别为22 kD和27 kD左右;Western blot结果显示,K196R和A240L蛋白均能够与ASF阳性血清发生较好的特异性反应;酶活检测结果表明,二者均具有一定的体外酶催化活性。利用大肠杆菌表达的ASFV K196R和A240L可溶性蛋白,具有较好的反应性和一定的体外酶催化活性,可为ASFV的诊断及蛋白的相关功能研究提供一定的依据。

非洲猪瘟病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立

为了实现非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)的快速检测,本研究建立了检测ASFV K196R基因的q PCR方法。按照K196R基因保守序列,设计1对特异性引物,建立并优化qPCR反应体系和反应条件,构建标准曲线,测定该检测方法的特异性、灵敏性和可重复性。结果显示,本研究建立的检测方法不与其他病毒的核酸样品产生交叉反应,检测灵敏度达10 copies/μL。变异系数小于2.5%,构建的标准曲线线性关系良好。上述结果表明,该检测方法特异性强、灵敏度高、重复性好,能够为ASF疫情防控提供技术支撑。