大肠杆菌K5多糖生物合成条件的优化

采用Plackett-Burman实验、正交试验设计方法对K5多糖的生物合成条件进行优化。然后,在摇瓶及5 L发酵罐中进行K5多糖发酵过程研究。结果表明:最佳培养基组成为麦芽糖20 g/L,蛋白胨15 g/L,MnCl4·4H2O0.1 g/L,MgSO4·7H2O 2.0 g/L,KH2PO42.0 g/L,K2HPO49.7 g/L,脱水枸橼酸钠0.5 g/L;250 mL摇瓶最佳装液量为15 mL。优化后5 L发酵罐中K5多糖的质量浓度为1.8 g/L,较优化前的0.3 g/L提高了5倍。

大肠杆菌K5多糖对糖尿病视网膜病变小鼠视网膜新生血管形成作用的研究

目的探究大肠杆菌K5多糖对糖尿病视网膜病变小鼠视网膜新生血管形成的影响。方法发酵培养大肠杆菌K5菌株,对培养液进行分离纯化制备K5多糖,并分析K5多糖的纯度;雄性ICR小鼠被随机分为正常组、模型组和干预组,其中正常组是健康小鼠,而模型组和干预组均使用链脲佐菌素建立糖尿病小鼠模型,干预组于造模后使用K5多糖干预4周,造模后8周各组取小鼠眼球组织,行HE染色及视网膜铺片ADPase染色;采用Real-time PCR和Western blotting检测各组小鼠眼球组织血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)及基质金属蛋白酶-2(matrix metalloproteinase,MMP-2)的表达情况。结果 HPLC结果显示制备的K5多糖纯度在95%以上;HE染色及ADPase染色结果显示正常组小鼠视网膜只见少量血管,模型组小鼠视网膜血管数目显著高于正常组,而干预组小鼠视网膜血管数目较模型组显著下降(P<0.05);Real-time PCR和Western blot结果显示,模型组小鼠眼球组织VEGF和MMP-2的mRNA及蛋白表达水平显著高于正常组(均为P<0.05),而干预组VEGF和MMP-2的mRNA及蛋白表达水平显著低于模型组(均为P<0.05)。结论大肠杆菌K5多糖能够抑制糖尿病视网膜病变小鼠视网膜新生血管形成,其作用机制可能与抑制VEGF及MMP-2的表达有关。

还原响应型K5多糖胶束药物载体的研究

为了解决传统抗肿瘤药物阿霉素水溶性不佳,对机体选择性差的情况,设计了一种还原敏感的K5胶束药物载体。将脱氧胆酸(DOCA)通过双硫键与K5多糖连接,制备两亲性K5PSSS-DOCA(KSD)缀合物。该缀合物在水溶液中可自组装形成胶束并包载模型药物阿霉素(DOX)。胶束形貌通过透射电镜进行观测,并进一步通过动态光散射测定其水合粒径及ζ-电位。胶束为球形,其水合粒径和ζ电位在载药前分别为225nm与-31mV,载药后为241nm与-31mV,具有较好的稳定性。该胶束在谷胱甘肽(GSH)存在条件下,可表现出明显的还原响应药物释放行为。细胞实验结果证实,载体材料有良好的生物相容性,含药胶束对肿瘤细胞的半数抑制浓度(IC50)低于正常细胞,对肿瘤细胞有明显选择性。

pH敏感型K5多糖-阿霉素前体药物的制备及其性能

利用肝素前体K5多糖,通过腙键(Hydrazone bond)连接抗肿瘤药物阿霉素(DOX),制备具有pH敏感性的K5-hydrazone-DOX(KHD)前体药物。对其载药量、形貌和体外药物释放等性质进行了研究,并通过HeLa细胞对其体外细胞毒性和细胞摄取进行了评价。结果表明,所制备的KHD前体药物中,DOX质量分数为18.0%。药物释放结果显示,KHD前体药物在pH 5.0条件下对DOX的释放率远高于pH 7.4条件下的释放率,具有明显的p H响应性。细胞实验表明,KHD前体药物可迅速被细胞摄取,并且具有肿瘤细胞抑制作用。本研究结果表明,KHD是一种有潜在应用价值的抗肿瘤前体药物。

pH-响应型K5多糖药物传递系统的构建及应用

化学疗法是目前癌症治疗的主要方法,但目前常用的化疗药物却普遍存在水溶性不佳、缺乏选择性、毒副作用大等不足,而限制了其应用。本研究基于肝素前体K5多糖为模板,利用具有pH响应性的硼酸酯键,构建了K5-脱氧胆酸(K5AD)两亲性药物传递系统,用于阿霉素(doxorubicin,DOX)的靶向传递释放。考察了该体系的体外药物释放行为,并在体外评价其对肿瘤细胞的抑制作用。结果表明,K5AD的临界胶束浓度值为23.5mg/L,在水溶液中能自组装形成平均粒径为196.7nm的胶束;K5AD-DOX体外药物释放实验显示其具有pH-响应的释药行为,在pH 5.0的酸性环境下药物释放速率较pH 7.4下更快。细胞实验表明,K5AD-DOX对肿瘤细胞的毒性远大于对正常细胞的毒性,表现出治疗的选择性。

基于K5多糖的pH响应型药物载体的制备及其抗肿瘤活性

采用组氨酸(His)对K5多糖进行修饰,制得了His取代度分别为20%、28%和39%的两亲性缀合物(KH1、KH2和KH3),再利用其可自组装形成纳米粒的性质包载多柔比星。随着取代度的增大,所得的载药及空白纳米粒的粒径均减小。其中,采用KH3的载药(DKH3)纳米粒在水溶液中分散均匀,水合粒径为207.7 nm,?电位为-22.1 m V,载药量和包封率为(10.25±0.05)%和(51.26±0.27)%。体外释放结果显示,与中性环境中相比,DKH3纳米粒在酸性环境下的释放快速而完全。细胞毒性试验表明,空白的KH3纳米粒对B16细胞和COS7细胞无明显毒性;而DKH3纳米粒对B16细胞和COS7细胞的IC50为1.97和13.3?g/ml,原料药则为0.66和0.86?g/ml。结合细胞摄取试验结果,可见所制备的DKH3纳米粒能有效提高药物对肿瘤细胞的治疗选择性。

可拮抗血清快速胞吞的K5多糖-阿霉素前体药物及其体外评价

目的:本研究利用肝素前体K5多糖连接抗肿瘤药物阿霉素(doxorubicin,DOX)制备具有p H敏感特性的K5多糖-阿霉素前体药物(K5-DOX),并在体外对其理化性质和活性进行评价。方法:通过希夫碱反应制备K5-DOX,对DOX负载量、K5-DOX在溶液中的形貌和体外药物释放等性质进行了考察。通过人宫颈癌He La细胞对其体外细胞摄取和细胞毒性进行评价。结果:成功制备K5-DOX,DOX含量为17.4%。药物释放研究发现,K5-DOX在p H 5.0酸性条件下DOX的释放速率远高于生理p H 7.4时DOX的释放速率,具有p H响应性。纳米粒子表面带负电荷,在含10%胎牛血清(FBS)溶液中表现出可拮抗血清的优良特性。细胞摄取结果表明,K5-DOX可迅速被细胞摄取,且其细胞摄取率远高于游离阿霉素。体外细胞毒性结果表明,K5-DOX具有良好的抗肿瘤活性。结论:结果表明,K5-DOX是一种具有潜在应用价值的抗肿瘤前体药物,K5多糖有望成为新一代药物载体。

K5多糖-胆固醇聚合物胶束的制备及其表征

目的:本研究以K5-胆固醇聚合物为抗癌药物阿霉素的载体,对其理化性质和细胞毒性进行评价。方法:胆固醇通过酰胺键与K5多糖连接,合成两亲性K5多糖-胆固醇聚合物(KC),通过其自组装包载阿霉素(DOX)制得载药胶束(DOX/KC)。用动态光散射仪测定DOX/KC粒径和动电势,用超滤法测定包封率和载药量,用透析法评价胶束的体外释放,采用MTT法评价细胞毒性,用倒置显微镜观察胶束的细胞摄取情况。结果:所制备的DOX/KC的平均粒径为(120.9±2.7)nm,动电势值为-(25.7±1.4)m V,包封率为(73.23±0.88)%,载药量为(8.137±0.45)%,透射电镜观察结果表明,胶束呈球形且粒径较均匀。体外药物释放研究表明,48 h时药物的累计释放率接近40%,具有明显的缓释作用。体外细胞毒性实验表明,KC对细胞无明显细胞毒性,展现出良好的生物相容性。DOX/KC对MCF-7人乳腺癌细胞具有显著的抑制作用,且呈浓度依赖性。细胞摄取结果表明,DOX/KC进入细胞有时间依赖性。结论:DOX/KC聚合物胶束具有缓释的特点,有用于肿瘤临床治疗的潜能。

K5裂解酶在大肠杆菌中的表达、纯化及酶学性质分析

K5多糖裂解酶(Elma)能够裂解半合成肝素的底物-K5多糖,裂解产物是半合成法生产低分子量肝素的底物。利用PCR方法扩增elma,构建表达载体pET-28a-Elma,将构建好的质粒转化至大肠杆菌BL21中,以0.2 mmol/L的IPTG在16℃诱导5 h实现了高效表达,SDS-PAGE分析表明Elma表达量可达菌体总蛋白的30%以上。采用Ni2+-NTA亲和层析法和G-75分子筛层析纯化目的蛋白,其纯度大于95%。通过PAGE多糖电泳发现裂解前后的K5多糖分子量有明显的减小。根据Elma裂解产物产生双键从而在232 nm处有吸光度的变化来测Elma的酶活。其最适反应温度为37℃,反应的最适pH值为7.0。底物特异性分析发现Elma除K5多糖外对肝素和透明质酸也有降解作用。