薯蓣皂苷的次皂苷元B体外诱导人慢性髓系白血病细胞K562凋亡的研究

背景与目的:我们从福州薯蓣的根茎中首次分离得到薯蓣皂苷的次皂苷元B(P.B),并发现P.B能够显著抑制多种人肿瘤细胞的增殖。本研究的目的在于探讨P.B是否通过诱导细胞凋亡而发挥其抑制肿瘤细胞增殖的作用。方法:采用荧光及透射电子显微镜观察细胞凋亡的形态学变化;库尔特全自动颗粒粒度分析仪分析药物引起K562细胞体积大小分布的变化;琼脂糖凝胶电泳测定DNA梯状带,流式细胞术检测细胞凋亡时的变化。结果:10μmol/LP.B处理K562细胞24h时,细胞产生典型的核内染色质凝结、核片段化、细胞体积缩小及凋亡细胞表面膜出泡等形态学特征。10μmol/LP.B分别处理K562细胞6、12及24h时,能够使细胞产生明显的DNAladder和体积变化,呈一定的时效关系,并且亚G1峰的凋亡细胞随作用时间的延长而增加,分别为6.12%(6h)、35.6%(12h)和45.7%(24h)。结论:P.B可能通过诱导K562细胞凋亡而发挥其抗K562细胞增殖的作用。

K562和K562/AO2细胞HLA I类分子与MICA/B的表达及其对NK细胞杀伤活性的影响

本研究探讨K562亲本细胞株及多药耐药细胞株K562/AO2细胞表面HLAI类分子和MHCI类链相关分子(MICA/B)的表达及其对NK细胞杀伤活性的影响。用流式细胞仪检测K562和K562/AO2细胞株HLAI类分子和MICA/B的表达情况;LDH释放法测定3例健康人NK细胞在不同效靶比时对K562和K562/AO2细胞的杀伤活性;效靶比10∶1时,用抗HLAI类分子单克隆抗体(W6/32)和抗MICA/B单克隆抗体(BAMO-1)分别封闭MHCⅠ类分子和MICA/B,观察NK细胞杀伤K562及K562/AO2细胞活性的变化。结果表明:K562和K562/AO2细胞均不表达HLAI类分子,K562细胞的MICA/B表达较K562/AO2明显增高(P<0.01)。效靶比5∶1、10∶1、20∶1、30∶1时NK细胞杀伤K562和K562/AO2细胞的活性分别为(29.32±0.12)%、(45.33±0.78)%、(58.37±0.87)%、(72.37±0.96)和(12.47±0.91)%、(24.36±1.11)%、(33.29±1.03)%、(53.87±1.27)%,各效靶比时NK细胞对K562细胞的杀伤活性较K562/AO2细胞明显增强(P=0.000);效靶比10∶1时W6/32不抑制NK细胞杀伤K562和K562/AO2细胞的活性,BAMO-1能明显抑制NK细胞杀伤K562和K562/AO2细胞的活性。结论:MICA/B在K562和K562/AO2细胞表达的差异与NK细胞的杀伤活性有关;NK细胞对K562/AO2细胞杀伤活性降低与HLAI类分子无关;MICA/B在多药耐药肿瘤细胞的低表达导致耐药肿瘤细胞对NK细胞杀伤敏感性下降。

蛋白酶体抑制剂硼替佐米对K562细胞株NF-κB活性及ICAM-1表达的影响

为了研究蛋白酶体抑制剂硼替佐米对急性白血病K562细胞株核因子κB(NF-κB)及细胞间黏附分子(ICAM-1)表达的影响,用含10%小牛血清的RPMI1640培养液体外培养K562细胞,用0、10、20、30、50、100nmol/L的硼替佐米干预K562细胞6小时后收集细胞。用SP免疫组织化学法测各组细胞NF-κB活性,并以反转录聚合酶链反应(RT-PCR)分析K562细胞ICAM-1表达的变化。结果表明:各药物处理组K562细胞NF-κB的活性和ICAM-1的表达均明显受抑制,与对照组相比,存在显著性差异(p<0.05),且各组NF-κB活性与ICAM-1表达成正相关。结论:蛋白酶体抑制剂硼替佐米可能通过抑制NF-κB活性下调细胞间黏附分子ICAM-1的表达,这为白血病靶向治疗提供了一个新的途径。

白血病K562/A02细胞MDR1、NF-κB的表达及解毒化瘀中药的调控作用研究

在白血病细胞的耐药机制中,核周因子NF-κB与肿瘤细胞的发生、增殖、分化、凋亡及耐药有密切关系,是多药耐药（multidrug resistance,MDR1）信号转导途径中的主要信号分子,在白血病细胞表达与耐药有关的因素中可能起关键的调控作用。本研究采用血清药理学方法和分子生物学技术研究解毒化瘀药含药血清对人白血病耐药细胞系K562/A02细胞NF-κB信号的影响,探讨解毒化瘀药对K562/A02耐药逆转机制。

携带pdcd5基因的增殖型腺病毒与VP-16杀伤K562细胞的协同作用

程序性细胞死亡因子5(programmed celldeath5,PDCD5)在多种肿瘤细胞中表达明显降低。携带pdcd5基因的靶向增殖型腺病毒SG611-pdcd5对白血病细胞具有杀伤作用,对正常细胞具有相对保护作用。本研究旨在观察联合应用SG611-pdcd5与低剂量化疗药物依托泊甙(etoposide,VP-16)对白血病细胞系K562的作用。以不同浓度梯度的药物或不同感染复数(multiplicity of infection,MOI)的病毒液作用于K562细胞,培养48小时后用MTT法检测细胞存活率。结果表明,与SG611-pdcd5(MOI=40)或VP-16(0.5μg/ml)单独作用组相比,SG611-pdcd5(MOI=40)+VP-16(0.5μg/ml)组细胞存活率明显降低(p均<0.05),分别为(59.45±4.12)%、(82.91±3.41)%及(42.00±5.75)%。SG611-pdcd5与VP-16的协同作用强于PDCD5蛋白或携带pdcd5基因的非增殖型腺病毒Ad-pdcd5与VP-16的协同作用(p均<0.05);VP-16浓度为4.0μg/ml时,VP-16+SG611-pdcd5(MOI=40)组、VP-16+proPDCD5(40μg/ml)组及VP-16+Ad-pdcd5(MOI=80)组细胞存活率分别为(37.09±1.89)%、(52.36±1.64)%及(73.64±4.33)%。结论:SG611-pdcd5具有促进低剂量VP-16杀伤K562细胞的作用,二者联合可增强对白血病细胞的杀伤作用。

三氧化二砷诱导K562细胞凋亡过程中IκB-α,NF-κB蛋白表达的研究

目的 探讨三氧化二砷 (As2 O3)诱导慢性粒细胞性白血病 K5 6 2细胞凋亡过程中 IκB- α以及 NF- κB的表达变化。方法 应用不同剂量 As2 O3诱导 K5 6 2细胞凋亡 ,以 Western- Blot免疫印迹电泳检测 NF- κB,IκB- α的表达 ,流式细胞术检测 K5 6 2细胞凋亡及分析 IκB- α的阳性表达率变化。结果 As2 O3可诱导 K5 6 2细胞凋亡 ,随着As2 O3浓度从 1μmol/ L 到 4 μmol/ L 的增高细胞凋亡率由 16 .0 %增加到 6 0 .6 % ,胞浆中 IκB- α阳性表达率则由88.1%减少到 4 9.2 % ,胞核中 p6 5量逐渐增加。结论 As2 O3可诱导 K5 6 2细胞凋亡 ,在此过程中伴有 NF-κB的激活 ,在一定剂量范围内激活的程度随着砷剂浓度的增加而增强。砷剂激活 NF-κB通过其抑制蛋白

miRNA-196b过表达对K562细胞增殖、凋亡及survivin、Cox-2表达的影响

背景与目的:BCR-ABL融合基因是慢性粒细胞白血病发病的分子病理基础,也是诊断慢性粒细胞白血病、观察疗效、评估预后等的有效指标。miRNA-196b在急性粒细胞白血病中低表达并对疾病的发展起主要作用。在慢性粒细胞白血病中miRNA-196b的靶基因为BCR-ABL,miRNA-196b过表达抑制BCR-ABL融合基因的表达。生存素(survivin)是BCR-ABL的一个下游基因,已在多种肿瘤中发现survivin与环氧化酶-2(Cox-2)协同调节细胞的增殖凋亡。本研究旨在探讨miRNA-196b过表达对K562细胞增殖、凋亡及survivin、Cox-2 mRNA表达的影响。方法:实验分为K562-196b组、空载K562-pLV组与K562组,采用CCK-8法检测细胞增殖;采用AnnexinⅤ-PE检测细胞凋亡;采用实时荧光定量PCR法检测Cox-2、survivin mRNA的表达情况。结果:miRNA-196b过表达可以明显抑制K562细胞增殖;K562-196b组细胞凋亡率显著高于K562组(P<0.05);miRNA-196b组中survivin基因显著低表达(P<0.05),Cox-2基因中无明显变化(P>0.05)。结论:miRNA-196b对K562细胞的增殖抑制和诱导凋亡有显著作用;miRNA-196b过表达可下调survivin基因的表达,为miRNA-196b作为慢性粒细胞性白血病的治疗靶点提供了依据。

高三尖杉酯碱对K562细胞NF-κB和BCL-2蛋白表达的影响

本研究旨在探讨高三尖杉酯碱(HHT)对K562细胞增殖、凋亡及BCL-2和NF-κB蛋白表达的影响。不同浓度HHT作用K562细胞后用MTT法、流式细胞仪、Western blot等方法分别检测细胞增殖、凋亡、BCL-2及NF-κB蛋白表达水平。结果表明,HHT作用48 h,浓度依赖性抑制K562细胞增殖,IC50为43.89 ng/ml。HHT 10 ng/ml作用48 h,K562细胞凋亡率明显增高;细胞周期阻滞于G0/G1期;BCL-2和NF-κB蛋白表达水平明显低于对照组(P<0.05)。结论:HHT对K562细胞有显著的增殖抑制、细胞周期阻滞和凋亡诱导作用,抑制NF-κB和BCL-2表达可能是其抗CML的机制之一。

钙离子载体上调K562细胞B7分子表达

目的:探讨钙离子载体(Calc ium ionorphore,C I)对慢性髓系白血病细胞株K562细胞表面B7分子表达的上调作用。方法:将生长状态良好的K562细胞在含C I(375 ng/m l)的培养基中培养,以不含C I培养的K562细胞作对照组。培养0、48和96小时后台盼蓝拒染法检测细胞数和细胞存活率,流式细胞仪检测培养前及培养96小时后细胞表面B7分子的表达情况,MTT比色法检测其刺激同种异体T细胞增殖的作用。结果:K562细胞表面B7分子缺如或低表达;用含C I的培养基培养96小时后,可显著上调B7分子的表达,且能明显激活同种异体T细胞。培养前后细胞形态无明显变化,加C I培养的K562细胞较不加C I培养的细胞生长缓慢。结论:慢性髓系白血病细胞株K562细胞表面存在B7分子表达缺陷,C I可上调其B7分子。C I可能有抑制K562细胞生长的作用。

野生型p16和p53抑癌基因共转染对K562细胞增殖的抑制作用

抑癌基因p1 6和 p53在抑制肿瘤的发生中起重要作用 ,在髓细胞白血病细胞系K562中检测出这两种基因有纯合缺失。为探讨野生型 p1 6和 p53基因的转染与表达对K562细胞的生长影响 ,采用了脂质体介导外源野生型 p1 6和 p53共转染K562细胞 ,用免疫细胞化学染色检测p1 6和 p53基因的表达 ,检测细胞生长曲线 ,采用流式细胞术进行细胞周期分析。结果显示 ,共转染后 p53和p1 6在K562细胞中表达阳性率分别为 2 3 %和 2 8% ;细胞生长受到一定程度的抑制 ,G1 期细胞的比例增加 ,S期细胞减少 ,与单独转染 p53或p1 6基因的抑制作用有明显差别 (P <0 .0 5)。结论 :外源野生型 p1 6和p53基因的共转染比转染单基因对K562细胞生长有更明显的抑制作用 。

不同浓度硼替佐米对K562/DNR细胞株NF-κB,IκB及P-gp表达的影响

目的:观察不同浓度硼替佐米(商品名万珂,PS-341)对柔红霉素(DNR)诱导的K562耐药细胞株(K562/DNR)核因子-κB(NF-κB)、抑制蛋白κB(IκB)及P-糖蛋白(P-gp)表达的影响,探讨PS-341逆转耐药的分子机制.方法:四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法(MTT法)进行耐药细胞株和PS-341细胞毒性的判定.以100mg/LDNR单用或联合应用0.4,4,40μg/LPS-341作用于K562/DNR36h,检测各组NF-κb,IκB及P-gp表达情况,并测定NF-κB活性,检测各组细胞凋亡率.结果:与阴性对照组相比,DNR可诱导NF-κB表达上调、IκB表达下调、P-gp表达上调;加用PS-341可显著抑制NF-κB表达,同时使IκB表达增加、P-gp表达下降,上述作用随PS-341浓度增加而增强.NF-κB活性(%)检测示:DNR组为25.9±2.5,DNR+0.4μg/LPS-341组为20.3±2.0,DNR+4μg/LPS-341组为6.1±2.5,DNR+40μg/LPS-341组为4.6±1.6,加入PS-341后,NF-κB活性受抑,该作用随PS-341浓度增加而增强.细胞凋亡率(%)检测结果示:DNR组为22.5±4.6,DNR+0.4μg/LPS-341组为31.0±5.2,DNR+4μg/LPS-341组为43.6±7.7,DNR+40μg/LPS-341组为56.0±9.3,加入PS-341后可提高DNR引起的细胞凋亡率,该作用随PS-341浓度的增加而增强.结论:PS-341可逆转白血病细胞耐药,该作用呈浓度依赖性.

K562细胞转p16基因前后流变学特性的改变

将 p16抑癌基因转入 p16阴性的人红白血病细胞株K562 ,采用微吸管技术并配合某些生物物理技术 ,研究K562细胞在转基因前后生物物理特性的改变。结果表明 ,p16基因的引入使K562细胞表面电荷密度增加 ,抗渗透破碎能力变差。用标准固体粘弹性模型拟合微吸管实验结果后 ,发现表征细胞最大变形能力的弹性系数K1 增加 ,而另一弹性系数K2 粘性系数 μ 无明显改变 ,说明p16使K562细胞刚性增大。这些结论将加深对 p16基因抑制肿瘤转移和基因治疗理论和实验的认识。

转染p16与dll4阻滞白血病细胞株K562细胞周期

本研究探讨p16,dll4基因真核表达载体在白血病细胞中的表达和作用,设计并构建包含野生型p16cDNA,dll4cDNA的真核双表达载体pBudCE4.1-16-dll4,用脂质体法转染白血病细胞,用Western blot方法检测外源性p16及dll4的表达情况;通过CCK-8和流式细胞仪检测细胞的生长曲线和周期。结果表明:成功构建p16、dll4基因双表达真核载体,体外成功转染入白血病细胞。在白血病细胞检测到外源性P16、Dll4蛋白的表达。转染48小时后,试验组与对照组比较,细胞周期被阻滞(p<0.001),细胞增殖下降(p<0.001)。结论:重组质粒pBudCE4.1-16-dll4体外转染白血病细胞后,两个目的基因能够在细胞中同时表达,并诱发细胞周期阻滞于G0/G1期。

解毒化瘀方含药血清对K562/A02细胞凋亡抑制蛋白及核周因子κB表达的影响

目的探讨解毒化瘀方含药血清对白血病K562/A02细胞凋亡抑制蛋白survivin基因和核周因子κB(NF-κB)信号基因表达的影响。方法将K562/A02细胞分为6个组,分别加入等体积牛血清,兔血清,高、中、低剂量中药血清和干扰素,并设K562敏感细胞株为对照。采用半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法检测解毒化瘀方含药血清处理后K562/A02细胞survivin的表达;Western blot法检测NF-κB/P65、NF-κB/P50、IκBα的表达。结果 survivin耐药基因在K562/A02细胞中高表达,加用解毒化瘀含药血清处理后,高、中剂量中药血清组和干扰素对照组能够survivin的表达明显降低。NF-κB在K562/A02耐药细胞亦呈高表达,加用解毒化瘀含药血清处理后,P65、P50和IκBα的表达均有不同程度下降,以高、中剂量组最明显,且高剂量组P65、P50表达下降优于干扰素对照组(P<0.05),IκBα下降与干扰素对照组相当(P>0.05)。结论解毒化瘀方能够降低K562/A02细胞NF-κB信号基因的表达,影响NF-κB-survivin途径逆转耐药。

MicroRNA-193b对K562细胞C-KIT蛋白表达及生物学行为的影响

本研究探讨microRNA-193b(miR-193b)对K562白血病细胞系C-KIT蛋白表达及生物学行为的影响。采用HiPerFect转染试剂介导FAM荧光标记的miR-193b mimic或阴性对照分别转染过表达C-KIT的K562细胞系,采用流式细胞术检测FAM阳性细胞百分比以监测转染效率,采用Western blot检测C-KIT和磷酸化C-KIT蛋白表达水平,采用CCK-8试剂检测细胞生长曲线,采用AnnexinⅤ染色后流式细胞仪检测细胞凋亡,采用流式细胞仪检测粒系分化标志CD11b和CD15阳性细胞百分比。结果显示,miR-193b或阴性对照转染的K562细胞中,FAM阳性细胞可达80%左右;与对照组相比,过表达miR-193b可明显抑制K562细胞中C-KIT、磷酸化C-KIT蛋白表达水平,同时,K562细胞的增殖受到抑制,凋亡细胞、CD11b阳性细胞、CD15阳性细胞的百分比均有增加。结论:miR-193b可抑制K562细胞C-KIT表达,并抑制细胞增殖;该增殖抑制作用可能与miR-193b诱导的细胞凋亡、分化有关,本研究为进一步分析miR-193b在白血病发生中的作用提供了实验依据。

丁酸钠上调白血病K562细胞CYP1A1和1B1基因的表达(英文)

目的研究丁酸钠(NaB)在诱导白血病K562细胞分化过程中,对细胞色素CYP1A1/1B1基因转录的作用及作用机制。因为与肿瘤发生发展密切相关,细胞色素P450(sCYPs)已经成为最有潜力的抗肿瘤药物的靶标。对于白血病细胞中这些基因表达机制的研究将有助于揭示它们在造血过程以及血液肿瘤发生中的作用。方法丁酸钠诱导K562细胞分化,RT-PCR检测CYP1A1/1B1转录水平的变化,染色质免疫沉淀(ChIP)分析乙酰化组蛋白H3和组蛋白乙酰转移酶p300与CYP1A1/1B1启动子的结合情况。结果丁酸钠在诱导白血病K562细胞分化过程中,促进了组蛋白乙酰转移酶p300与启动子区域的结合、升高了CYP1A1/1B1基因启动子组蛋白H3乙酰化修饰水平、上调了CYP1A1/1B1基因的转录。结论组蛋白乙酰化修饰和组蛋白乙酰转移酶p300参与了丁酸钠诱导的白血病K562细胞CYP1A1/1B1基因的转录。

铁剥夺对柔红霉素诱导K562细胞多药耐药基因1表达及NFκB活化的影响

目的:探讨铁剥夺对柔红霉素(DNR)诱导K562细胞多药耐药基因1(MDR1)表达及核因子κB(NFκB)活 化的影响。方法:以1.0μmol/LDNR单用或联合应用25μmol/L去铁胺(DFO)作用于人红白血病细胞株K56224h 后,应用RT -PCR法、流式细胞仪分别检测对照组、DNR组和DNR+DFO组K562细胞MDR1mRNA和P糖蛋白 (Pgp)的表达情况,同时采用凝胶滞留试验检测NFκB的转录活性水平。结果:与对照组相比,DNR可同时诱导MDR1 mRNA、Pgp表达上调和NFκB活化增强(P<0.05);DFO联合DNR可显著抑制DNR诱导的MDR1mRNA、Pgp表达及 NFκB活化(P<0.05)。结论:铁剥夺可减少DNR诱导的MDR1、Pgp表达,其机制可能与抑制NFκB活化有关。

下调miR-125b以抑制白血病K562细胞的增殖

目的:探讨下调mi R-125b对白血病K562细胞的增殖抑制作用及相关机制。方法:利用LipofectamineTM2000脂质体将mi R-125b inhibitor和mi R-125b NC转染于白血病K562细胞中,应用RT-PCR法检测mi R-125b表达,MTT法检测细胞活力,琼脂糖形成实验检测细胞集落形成能力,流式细胞术检测细胞周期,Western blot检测细胞中BCL-2、BCL-2同源拮抗物1(Bak1)、p53及p53正向细胞凋亡调控因子(Puma)表达。结果:与mi R-125b NC比较,mi R-125b inhibitor组mi R-125b表达下调(P<0.01),细胞活力及细胞集落形成能力降低(P<0.01),细胞周期阻滞在G1期(P<0.01),BCL-2表达下调(P<0.01),BAK1、p53和Puma表达上调(P<0.01)。结论:mi R-125b表达量下调能显著地抑制白血病细胞K562的增殖,这一效应与下调BCL-2表达、上调BAK1、p53及Puma表达有关。

LRP16基因对慢性髓系白血病K562细胞促增殖作用的研究

本研究探讨超表达LRP16基因对人慢性髓系白血病K562细胞增殖的影响。采用RT-PCR法扩增人LRP16基因开放阅读框(open reading frame,ORF)片段,将其连接到pGEM-T质粒以构建LRP16基因ORF-pGEM-T重组载体。再将测序鉴定过的LRP16基因ORF插入pcDNA3.1+质粒以构建LRP16基因ORF-pcDNA3.1+重组表达质粒,转染K562细胞,建立稳定超表达LRP16基因的K562细胞系。用MTT法测定细胞存活率并绘制生长曲线,流式细胞术检测细胞周期。结果表明:成功扩增出人LRP16基因ORF片段,并构建LRP16基因ORF-pcDNA3.1+重组表达质粒;建立稳定超表达LRP16基因的K562细胞系;超表达LRP16基因具有促进K562细胞增殖的作用,且这种促增殖作用部分是通过促进细胞由G0期进入S期而实现的。结论:超表达LRP16基因可促进K562细胞增殖。

辛伐他汀诱导裸鼠体内K562细胞凋亡过程中NF-κB通路的分子变化

目的:探讨辛伐他汀在裸鼠体内引起的K562细胞NF-κB信号通路的分子变化,以说明辛伐他汀是否依赖NF-κB信号通路参与K562细胞凋亡发生。方法:体外培养慢性粒细胞白血病细胞株K562细胞,接种于18只BALB/c-nu/nu裸小鼠皮下,构建移植瘤模型。随机分为3组,每组6只。对照组腹腔注射生理盐水0.2 ml,两个处理组分别注射0.2 g/L的辛伐他汀0.25 ml(0.05 mg)和0.4 ml(0.08 mg)。均隔日注射,连续6次。采用TUNEL法检测K562细胞早期凋亡的变化,RT-PCR检测K562细胞中NF-κB信号通路IKK-βI、κB-α、NF-κB1 mRNA的差异表达。结果:不同剂量的辛伐他汀能够诱导裸鼠体内K562细胞发生明显的凋亡,且高剂量组凋亡率高于低剂量组(P<0.01);不同剂量的辛伐他汀能够引起IKK-β、IκB-α、NF-κB1 mRNA的表达下调(P<0.01)。结论:辛伐他汀可诱导K562细胞凋亡,可能与NF-κB通路基因的表达下调有关。