D-氨基酸氧化酶/D-丙氨酸系统杀伤K562e细胞的作用机制探讨

目的 :探讨 D-氨基酸氧化酶 (DAAO) / D-丙氨酸 (D - Ala)系统用作自杀基因治疗白血病的作用机制。方法 :以 D- Ala杀伤稳定表达 DAAO和绿荧光蛋白 (GFP)的高致瘤性 K 5 6 2 e单克隆细胞 KDf Gd、KDf GC,应用 MTT法检测细胞存活率 ,并用酚红氧化法测定培养上清 H2 O2 和 L owry法测定细胞蛋白数量 ,流式细胞仪测定细胞 GFP的荧光强度。结果 :在 2 5 m mol/ L D-Ala作用下 2 4 h即可完全杀死 KDf Gd细胞 ,当 D- Ala为 2 0 mmol/ L 时延长作用时间至 4 8h,杀伤率由 6 4 %增加至 96 .8% ,而D- Ala≤ 15 mm ol/ L 时杀伤率增加不明显。低于 2 0 m mol/ L,D- Ala对 K5 6 2 e几乎无杀伤作用。培养上清的 H2 O2 变化与杀伤转基因细胞作用相一致。 结论 :DAAO/ D- Ala系统可能是通过产生 H2 O2 发挥杀伤转基因 K5 6 2

IRES序列连接的D-氨基酸氧化酶与绿色荧光蛋白基因导入K562e细胞的表达

内部核糖体进入位点 (IRES)序列来源于脑心肌炎病毒 ,它可翻译一条mRNA上的两个开放读框 ,由其连接的两个基因的表达率相同。本实验应用以IRES序列连接D 氨基酸氧化酶 (DAAO)和绿色荧光 (GFP)基因构建的逆转录病毒载体 ,转染K5 6 2e细胞获得稳定表达GFP的单克隆细胞KDfGC和KDfGd,测定转基因细胞的荧光阳性率以及荧光强度 ,用D 丙氨酸 (D Ala)作用DAAO+细胞 ,并用酚红氧化法测定培养上清H2 O2 。结果表明 ,KDfGC和KDfGd细胞的荧光阳性率分别为 94 .6 4 % ,96 .31% ;2× 10 4细胞的荧光强度分别为 2 0 2U和 174U。GFP荧光强度与H2 O2 的产量间呈指数相关。结论 :IRES序列调控的双基因可同时表达 ,GFP的荧光强度可以间接地反映DAAO基因的表达水平 ,为了解目的基因表达水平高低提供了新的方法。