野生型发根农杆菌K_(599)的解毒

本研究利用DNA重组技术构建了来源于质粒 pJBJ10 6、pBluescriptSK(+ )和pUCD80 0 的新质粒 pXT3sacB ,利用该质粒通过同源重组切除了野生型发根农杆菌K599中Ri质粒的T DNA。解毒后的K599获得了氨苄 /羧苄青霉素抗性和 10 %蔗糖抑制生长的选择标记。解毒后的K599菌株可能对农杆菌转基因技术是有益的。

黄瓜‘中国龙’毛状根诱导体系的建立

黄瓜是全球范围内重要的经济作物。建立黄瓜基因组测序品种‘中国龙’的毛状根诱导体系，可为今后分析黄瓜基因功能、挖掘黄瓜优良基因提供技术支撑。本文以‘中国龙’为材料，从种子表面灭菌方法、发根农杆菌的侵染浓度和共培养时间3方面，研究发根农杆菌菌株K599对‘中国龙’毛状根诱导的情况。结果表明，75％（φ）的乙醇先处理种子30s，再用5％的次氯酸钠灭菌5—10min的种子消毒方法，农杆菌菌液OD600值在1．2左右时进行侵染，共培养2天，是获得‘中国龙’毛状根的适宜组合方法。PCR扩增结果证实，经这样诱导出的黄瓜毛状根中，发根农杆菌Ri质粒的rolC基因已在黄瓜毛状根基因组中整合并得到表达。试验探索出了一套适合‘中国龙’毛状根诱导的方法。

发根农杆菌介导西瓜转基因过表达体系的建立

【目的】建立发根农杆菌介导的西瓜转基因不定根过表达体系。【方法】探索利用野生型发根农杆菌K599侵染西瓜材料‘Sugar Baby’,诱导西瓜产生不定根的实验方法。借助该方法,将含有GUS基因和EGFP基因的过表达载体pCAMBIA3301和pCAMBIA1300-ProSuper导入发根农杆菌K599,侵染西瓜材料‘Sugar Baby’,通过常规PCR、qRTPCR、GUS染色和激光共聚焦显微镜检测,评价该过表达体系的效果。【结果】利用野生型和导入外源质粒的发根农杆菌均能成功诱导西瓜‘Sugar Baby’产生不定根。PCR检测结果显示,携带pCAMBIA3301和pCAMBIA1300-ProSuper载体的发根农杆菌K599诱导产生的不定根阳性率达到100%。qRT-PCR、GUS染色和激光共聚焦显微镜检测均能成功检测到GUS基因和EGFP基因的过量表达。【结论】利用发根农杆菌K599诱导西瓜产生不定根介导基因过表达的方法,具有周期短,操作方便,转化率高的特点,可实现基因功能的快速验证,为西瓜根系相关基因的功能研究提供技术支持。

发根农杆菌介导甜瓜转基因过表达体系的建立

遗传转化是实现基因功能验证和基因快速转育的重要手段,但目前甜瓜的遗传转化依旧存在众多技术难题。笔者利用野生型发根农杆菌K599侵染甜瓜’E31’,成功诱导甜瓜产生了不定根。借助该技术,将含有GUS基因和EGF基因的过表达载体pCAMBIA3301和pCAMBIA1300-ProSuper导入发根农杆菌K599,利用转化后的农杆菌侵染甜瓜’E31’,成功诱导出了不定根。PCR检测结果表明,新生不定根的阳性率达到100%。通过GOS染色和激光共聚焦显微镜检测,在不定根中检测到GOS基因和EGFP基因的大量表达,成功实现了外源基因在甜瓜新生不定根内过表达。该方法周期短、操作方便、转化率高,可实现基因功能的快速验证,为甜瓜根系抗病抗逆方面的研究提供技术支持。

发根土壤杆菌介导的大豆发根转化体系改进

鉴于大豆难以获得转基因植株的现实,借鉴Kereszt等建立的发根土壤杆菌(Agrobacterium rhizogenes)K599介导的大豆转化体系,并针对实验中遇到的具体问题,对原体系进行了适当改进。结果表明:改进的体系操作更简单,对发根培养条件、人员操作技能要求更低,所形成的植株更具生命力。同时,应用改进体系以及RNAi技术,构建了表达线虫特异基因dsRNA的转基因发根植株,可在60 d内在转基因大豆发根上对植物线虫基因的RNAi效果完成验证。改进的体系为培育抗大豆胞囊线虫品种奠定了基础。