伪狂犬病病毒BarthaK61株Us区缺失片段的鉴定

为利用PCR技术对伪狂犬病病毒（PRV）BarthaK61株us区的具体缺失情况进行分析，根据已发表的PRV全基因组序列设计了4对引物，以PRV双城株基因组作为对照，对us区进行扩增。对扩增片段的序列分析表明，BarthaK61株基因组的Us区缺失了3489bp，为第122560～126049位核苷酸，其间包括部分gI基因、全部的gE和Us9基因以及部分Us2基因。

表达绿色荧光蛋白的伪狂犬病毒Bartha-K61株TK^-突变株的构建

提取伪狂犬病毒(PRV)Bartha-K61株基因组DNA为PCR扩增模板,并根据GenBank已发表的PRVKa plan株UL区UL25、UL24、UL23、UL22基因序列,选择保守序列设计了两对引物,分别扩增出位于UL23(TK)两侧(含部分TK基因)的可用于同源重组的左臂片段(L)和右臂片段(R),L包括部分UL25、全部UL24、部分TK,R包括部分TK及部分UL22,L和R的拼接片段中TK基因内部缺失270个核苷酸。将L片段和R片段克隆于pBluescriptM13-载体上,获得pSKLR;再将绿色荧光蛋白载体pEGFP-C1上含GFP及其多克隆位点的完整的基因表达盒插入pSKLR的L片段和R片段之间构成转移载体pSKLRG。提取pSKLRG质粒,经单酶切线性化后用脂质体与PRVBartha-K61株共转染143TK-细胞,在细胞培养液中有5 溴脱氧尿嘧啶(BrdU)存在的条件下筛选出表达绿色荧光蛋白的重组PRVBartha-K61毒株:PRVrBGFP。

Bartha K61株活疫苗对猪伪狂犬变异毒株和传统毒株的免疫保护效力分析

为了分析猪伪狂犬病活疫苗Bartha K61株预防流行变异毒株的效力。以经典PRV-EA株和变异PRV-XT株为攻毒毒株,评价Bartha K61活疫苗免疫仔猪对伪狂犬病病毒变异株的保护效力。用Bartha K61株活疫苗免疫4~5周龄断奶仔猪,免疫28 d后,分别用PRV-EA株和流行变异PRV-XT株攻毒,观察仔猪的临床症状和病理变化,检测鼻腔排毒情况。结果显示,Bartha K61株活疫苗可对经典PRV-EA株攻毒提供良好的免疫保护,但对变异毒株PRV-XT仅能提供部分保护。PRV-EA株攻毒组所有猪只未出现明显临床症状,而PRV-XT攻毒组出现较为明显的临床症状。表明Bartha K61株活疫苗对传统毒株有良好保护效果,而对流行变异毒株不能提供完全保护。

猪伪狂犬Bartha-K61株疫苗应用效果

猪伪狂犬病(PR)是由猪伪狂犬病病毒(PRV)引起的一种高度接触性传染病,可引起母猪流产,仔猪神经症状、腹泻、呼吸道综合征、生长发育受阻等,同时也是引起猪呼吸系统疾病的重要病原之一。PRV感染的流行及其可能造成的经济损失,已导致一些国家考虑从其猪群中根除PRV,通过淘汰血清学阳性的猪只以消除感染。

Bartha-K61株净化猪伪狂犬病应用试验

一、猪场信息福建某规模化种猪场,基础母猪800头,自2014年以来一直使用某疫苗厂家生产的猪伪狂犬病(PR)弱毒活疫苗(Bartha—K61株),猪群生产成绩稳定,健康状况良好,连续抽样监测显示种猪群gE抗体阳性率低于10%,并于2016年正式展开猪群伪狂犬病野毒免疫净化工作,2018年顺利通过国家相关部门验收工作。

伪狂犬Bartha-K61株弱毒疫苗临床应用效果研究

猪伪狂犬病毒属于双链DNA病毒,相对稳定,只有一个血清型,目前为止还未发现抗原性不同的伪狂犬病毒毒株。2011年以来猪伪狂犬病有所抬头,多个地区猪场、实验室检测分离出变异的PRV毒株,它们对易感猪的致病力增强,免疫猪的保护力也相应减弱。

猪伪狂犬病活疫苗(Bartha K61株)对变异株的保护效力

本研究旨在检测仔猪免疫猪伪狂犬病活疫苗（Bartha K61株）后,抵抗伪狂犬病病毒（PRV）变异株攻击的保护效果。取4～6周龄PRV抗体阴性仔猪,接种猪伪狂犬病活疫苗,1周后用PRV变异株（AH02LA株）攻毒,检测攻毒后临床症状、直肠温度、鼻腔排毒和肺部病变。疫苗免疫组在免疫后7 d均可以检测到gB抗体。攻毒对照组攻毒后出现典型伪狂犬症状,发病率为100%,死亡率为60%,所有猪只鼻拭子均检出排毒,所有猪只肺部均有出血、淤血等病变。免疫组的猪只攻毒后,所有猪只均未出现明显临床症状,部分猪只鼻拭子检出排毒,排毒持续时间缩短,排毒量显著减少,所有免疫猪只肺部未见明显病变。结果表明：伪狂犬病活疫苗免疫猪后对PRV变异株的攻击具有良好的保护效果。

基于US区缺失位点猪伪狂犬病病毒疫苗株与野毒株鉴别诊断方法的建立

依据GenBank中公布的猪伪狂犬病病毒全基因组序列,针对gI、gE、28K、TK四个基因序列,设计、合成了5条引物,并对野毒株SA株、gI-/gE-/PRVSA双基因缺失株和Bartha K61疫苗株进行了扩增,得到2061bp、1323bp、801bp和963bp特异性目的条带,其中BarthaK61疫苗株基因组检测最小浓度为136pg/μL。建立了针对野毒株和两种疫苗株的鉴别诊断方法。

带BAC质粒的重组伪狂犬病毒的构建及其体外生长特性研究

本研究通过基因克隆技术以伪狂犬病病毒(PRV)弱毒疫苗株Bartha K61株的部分TK基因作为同源重组序列,以绿色荧光蛋白基因(EGFP)作为筛选标记,构建了带LoxP位点的pUCTKAB-EGFP质粒,将pBeloBACII线性化后插入到pUCTKAB-EGFP中构建了转移载体pUCTK-EGFP-BACII。将PRV基因组和转移载体共转染Vero细胞,利用同源重组在Bartha K61株的TK基因中插入了BAC质粒和绿色荧光蛋白筛选标记,经过11轮噬斑纯化和鉴定证实获得了带BAC质粒的重组伪狂犬病毒rv-PRVBAC。通过噬斑试验和一步生长曲线测定等方法对重组伪狂犬病毒rv-PRVBAC的生长特性进行研究,结果发现带有BAC质粒及筛选标记的重组病毒rv-PRVBAC在体外细胞培养中的增殖速度与亲本毒Bartha K61株相比没有明显差别,说明大的基因片段的插入没有影响重组病毒在体外的繁殖速度。重组病毒rv-PRVBAC在Vero细胞上盲传18代,其绿色荧光蛋白仍能够稳定表达,通过PCR鉴定可以检测到插入的外源片段和插入位点两侧的病毒基因序列,表明所获得的重组病毒rv-PRVBAC得到了稳定遗传。本研究成功获得了带BAC质粒的重组伪狂犬病毒rv-PRVBAC,为进一步开展PRV的细菌人工染色体的构建奠定了基础。

执着创新 缔造百年永顺

2008年,广东永顺生物制药股份有限公司(以下简称永顺生物)和中国兽医药品监察所共同研发的ST猪瘟活疫苗(传代细胞源)上市。经过十余年刻苦努力研发,2018年7月,永顺生物ST传代细胞源家族迎来了新的成员——猪伪狂犬病活疫苗(Bartha-K61株,传代细胞源)获得了新兽药证书,将为养猪场提供预防猪伪狂犬病新的利器。日前,本刊记者采访了永顺生物总经理林德锐、常务副总骆善军,以此来了解永顺生物的发展和优势。