猪产肠毒素性大肠杆菌野生株K88菌毛蛋白结构基因的克隆与序列测定

根据报道的猪产肠毒素性大肠杆菌K88菌毛结构基因DNA序列 ,在其保守区用Goldkey软件设计了 1对引物 ,经PCR扩增从 2 0株野生分离株质粒中得到 17个大小在 815bp左右的阳性产物 ,经纯化、连接、转化、筛选及核酸序列测定与分析 ,确认所克隆的外源基因与报道的K88菌毛 (亚单位K88ab、K88ac、K88ad)蛋白结构基因序列一致 。

大肠杆菌K88ac菌毛操纵子fae全基因的克隆、表达及生物学活性初步研究

目的:在体外克隆和表达猪肠产毒性大肠杆菌(ETEC)K88ac菌毛操纵子fae结构基因,并检测重组菌毛的相关生物学活性。方法:利用长PCR技术以猪ETECK88ac株C83902基因组DNA为模板扩增编码K88菌毛操纵子fae基因,克隆入表达质粒载体pBR322,构建和筛选重组质粒pBR322-fae,转化至不含任何菌毛的大肠杆菌EP株;电镜观察重组菌表面菌毛表达情况;用热抽提法提纯表达的重组菌毛;用纯化菌毛免疫小鼠制备高效价抗血清;用SDS-PAGE和Westernblot检测重组菌毛的抗原性,用细胞黏附和黏附抑制试验检测其生物学活性。结果和结论:在电镜下观察到重组菌表面大量表达K88ac菌毛,该重组菌与兔抗K88ac菌毛单因子阳性血清、鼠抗K88ac菌毛单克隆抗体均产生凝集反应;纯化菌毛经SDS-PAGE,结构单位菌毛呈单一的相对分子质量约26×103的蛋白条带;纯化菌毛免疫小鼠后可制备出高效价的鼠抗血清,玻板凝集试验和Westernblot结果表明体外表达的K88ac菌毛具有与K88ac野生菌毛相同的抗原性;猪小肠上皮细胞系黏附和黏附抑制实验结果表明重组EP菌和野生菌株一样具有较强的黏附猪小肠上皮细胞系的能力,而且提纯重组菌毛制备出的鼠抗血清能有效抑制上述重组菌或野生菌株对猪小肠上皮细胞系的黏附结合。

产肠毒素大肠杆菌K88菌毛蛋白与大肠杆菌不耐热肠毒素b亚单位的原核表达及其鼻腔免疫效果

目的原核表达产肠毒素大肠杆菌(Enterotoxigenic Escherichia coli,ETEC)K88菌毛蛋白与大肠杆菌不耐热肠毒素(Heat-labile enterotoxin,LT)b亚单位(LTb),并评价其鼻腔免疫效果。方法采用PCR技术分别扩增不含信号肽的K88和LTb基因,克隆至表达载体pQE30中,构建重组表达质粒pQE30-K88和pQE30-LTb,转化大肠杆菌M15,IPTG诱导表达。表达的重组K88和LTb蛋白纯化、复性后,进行SDS-PAGE分析。分别用K88单独、K88联合LTb滴鼻免疫BALB/c小鼠,以生理盐水作为对照,每次间隔1周,共4次,末次免疫后10 d,分离血清,并收集鼻腔和小肠黏膜冲洗液,间接ELISA法检测各组血清特异性IgG和黏膜sIgA抗体水平。结果重组表达质粒pQE30-K88和pQE30-LTb经双酶切和测序证实构建正确;表达的重组K88和LTb蛋白相对分子质量分别为28 100和12 500,表达量分别约占菌体总蛋白的35%和40%,主要以包涵体形式存在;纯化复性后的重组蛋白纯度均可达95%以上。K88联合LTb滴鼻免疫组血清特异性IgG及鼻腔、小肠黏膜冲洗液中特异性SIgA水平均较K88单独免疫组和对照组明显增高,且差异有统计学意义(P<0.01)。结论在大肠杆菌中高效表达并纯化了重组K88和LTb蛋白,K88联合LTb滴鼻免疫BALB/c小鼠后,可增强特异性血清抗体反应,且诱导了黏膜免疫应答,为将来开发新型的ETEC基因工程疫苗奠定了基础。