仔猪黄痢K88-K99-987p-F41多价菌毛混合油乳剂灭活疫苗的制备及小鼠免疫保护试验

根据我国仔猪大肠杆菌性腹泻流行的实际情况 ,用产菌毛粘附因子的野生分离菌株HN2 0 0 1(K88ab)、HN2 0 0 2 (K88ac)、HN2 0 0 3(K88ad)、HN2 0 0 4 (K99)、C83915 (987p)及C836 2 1(F4 1)提取菌毛制成 5批多价菌毛混合油乳剂灭活苗 ,5批多价灭活疫苗对小鼠的平均保护率达 95 0 % (38 4 0 )。

仔猪黄痢K88-K99-987p-F41多价菌毛疫苗的制备及小鼠免疫试验

为了更好地预防仔猪黄痢,选取野生分离菌株HN2001(K88ab)、HN2002(K88ac)、HN2003(K 88ad)、HN2004(K 99)、HN2005(987p)和HN2006(F41)培养后用低温磁力搅拌法提取菌毛,制成5批多价菌毛混合油乳剂灭活苗。试验结果表明,5批多价灭活疫苗对小鼠的平均保护率达95.0%,为进一步进行本体动物试验提供了有价值的参考资料。

猪大肠杆菌K88-K99 PCR诊断试剂盒研究

根据已成功扩增的大肠杆菌K88及K99菌毛蛋白结构基因PCR反应 ,进行PCR反应体系的优化。将 2种菌毛蛋白结构基因的扩增引物混合进行PCR ,同时检测K88及K99菌毛蛋白结构基因。经优化试验 ,筛选出 5 0 μLPCR反应体系中各成分的最适用量为 :Mg2 + 浓度 2mmol L ,Taq酶 5U ,dNTPs 2 0 0mmol L ,每条引物 5 0pmol,模板量 1 0 0CFU ,并研制成功用于临床检测的PCR诊断试剂盒。

应用K88-K99 PCR试剂盒检测大肠杆菌研究

用研制的K88-K99 PCR诊断试剂盒对湖北省和江苏省的5个猪场238个病猪粪便进行了检测。扩增结果是K88检出率92.0％(219/238);K99检出率89.1％(212/238);阳性对照检出率100％,阴性对照未扩增到目的DNA片段。结果表明,运用PCR试剂盒检测具有快速、特异的优点,可同时处理大量样品,且可直接对粪便样品进行检测,值得进一步推广。

大肠杆菌K_(88)-K_(99)抗原工程苗对仔猪黄痢的预防效果

为预防仔猪黄痢病,我们应用大肠杆菌K88-K99抗原工程苗在丽水市良种场进行了预防接种,取得了较好的效果,现简述如下。材料和方法一、菌苗:上海植物生理研究所生产的大肠杆菌 K88-K99抗原工程苗。

K_(88)-K_(99)遗传工程苗防制羔羊痢疾

1983年以来,农一师某团新生羔羊连年发生羔羊痢疾,死亡率高达80%以上,经反复调查,病原为大肠杆菌,血清型较为复杂。1986年我们用K_(88)K_(99)遗传工程苗(以下简称工程苗)进行了小区免疫效果试验。报告如下:

K88和K99双价基因工程菌C株与E株表达效果的比较

应用ＬＢ培养基３７℃、１５０ｒ／ｍｉｎ振荡培养１７小时，室温４０００ｒ／ｍｉｎ，离心３０分钟，收集沉淀菌体，用ＰＢＳ离心洗涤一次，沉淀物重悬于适量的ＰＢＳ中。三等分菌体悬浮液分别用超声波、冻融、热休克等方法处理后，室温８０００ｒ／ｍｉｎ离心３０分钟，取上清液加入饱和硫酸铵４℃过夜，沉淀蛋白经透析，ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－１５０过柱纯化。应用ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、凝胶扫描测定Ｋ８８、Ｋ９９蛋白的分子量及浓度，双向免疫扩散、ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｉｎｇ试验测定其抗原性。结果表明，热休克法分离纤毛抗原是最好的方法，从Ｃ株Ｅ株分离得到的纤毛抗原，在分子量大小及对单抗亲和反应能力方面没有明显的差异。

ETEC K99、K88菌毛蛋白抗原表位多肽的设计合成及免疫反应

目的:通过生物信息学及蛋白分析软件等,寻找ETEC K88、K99菌毛蛋白的抗原表位。方法:通过生物信息学技术、DNAStar Protean蛋白分析软件及网络共享软件对ETEC K88、K99菌毛蛋白抗原性相关的参数进行预测分析,从而设计ETEC K88、K99菌毛蛋白的抗原表位多肽;采用腹腔注射的方式将合成的抗原表位多肽免疫小鼠,用ELISA法检测血清中产生的抗体,并对免疫小鼠进行了攻毒试验。结果:多肽免疫小鼠后均能诱导抗体产生,攻毒试验表明合成肽对小鼠具有保护作用。结论:成功预测了抗原表位,合成的表位多肽具有较好的抗原性。

产肠毒素性大肠杆菌K88与K99菌毛蛋白的串联表达

根据GenBank中发表的E.coliK88、K99基因序列,分别设计合成1对引物。利用PCR技术,以大肠杆菌C83907和C83644的质粒为模板分别扩增不含信号肽的K88及K99基因。通过分离、纯化、限制性核酸内切酶酶切、连接和转化,构建了含K88-K99串联表达载体的重组菌株BL21(DE3)(pETK88CK99)。结果显示,经酶切、PCR鉴定和DNA序列分析,证实了构建的重组质粒pETK88CK99中含有K88K99融合基因,且基因序列和阅读框架均正确。经过SDS-PAGE分析,串联表达蛋白含量占菌体蛋白的40%左右,经Western blotting检测,该串联表达蛋白能被大肠杆菌K88、K99标准血清识别。结果表明,构建的重组菌株可以作为预防新生仔猪大肠杆菌性腹泻基因工程疫苗的候选菌株。

幼畜腹泻双价基因工程疫苗(K88、K99)抗原蛋白的生产工艺

本文报道了在幼畜腹泻双价基因工程菌(K88、K99)的高密度发酵和抗原蛋白基因过量表达的研究基础上生产抗原蛋白疫苗的工艺。高密度发酵的工程菌(K88、K99)发酵液经65℃保温处理、离心除去菌体,清液部分含发酵液中抗原量的80%,加聚乙二醇(至最终浓度为7%)沉淀可回收全部抗原蛋白,加消毒的生理盐水溶解及稀释后分装冻干制成抗原蛋白疫苗。疫苗的组成份主要有分子量为52、36、22、18kd的蛋白。此法制备的双价疫苗不经甲醛处理,保持了抗原蛋白的天然空间结构,因此用其免疫怀孕的母猪、分娩后母猪乳汁中含有较高效价的抗体、能中和肠毒素大肠杆苗,有效地保护了仔猪黄痢的危害。

共表达ETECK99、K88菌毛蛋白重组干酪乳杆菌的构建

将PCR扩增的K99和K88-LTB基因片段串联插入到干酪乳杆菌细胞表面表达载体pLA中,构建了重组表达载体pLA-K99-K88-LTB,将其电转化干酪乳杆菌CICC 6 105,获得了表达融合蛋白pLA-K99-K88-LTB的重组干酪乳杆菌表达系统。重组干酪乳杆菌在MRS培养基中表达后,经SDS-PAGE检测,约有90 KDa的融合蛋白得到表达,蛋白大小与理论值相符合。Western-blot分析表明表达的蛋白可被鼠源K99,K88抗血清所识别。间接免疫荧光技术和流式细胞术的结果表明,融合蛋白成功地利用多聚谷氨酸跨膜蛋白pgsA基因展示在干酪乳杆菌菌体表面。

猪K_(88)、K_(99)、987P、F_(41)埃希氏大肠杆菌高密度发酵培养技术的初步探讨

采用高密度发酵和普通深层通气两种方法培养含K88、K99、987P、F41菌毛抗原的四株猪埃希氏大肠杆菌,对其培养液进行活菌数、OD值、pH值、效价的测定。实验结果表明,运用高密度发酵方法培养,各菌活菌数可达4.1×1010~4.9×1010CFU/mL,效价为211~213;运用普通深层通气方法培养,各菌活菌数为0.51×1010~0.59×1010CFU/mL,效价为24~25,可选择高密度发酵方法替代普通深层通气方法培养,用于制备猪埃希氏大肠杆菌K88、K99、987P、F41四价菌毛提纯苗。

分别含K88,K99和LT-B亚单位抗原基因的重组痘苗病毒的构建

本文构建了分别含K88,K99和LT-B亚单位抗原基因的重组痘苗病毒,并观察了这3种基因的表达情况。首先将K88亚单位基因克隆入痘苗转移或体PGJP-5中,得到嵌合质粒P_5-K88,将K99和LT-B亚单位基因分别克隆至痘苗转移载体PJ16中,得到重组质粒PJK-9和PLT-B。再经细胞体内同源重组技术,将以上3种基因分别插入到痘苗病毒天坛株的TK基因中,经5-BUdR的选择压力在人TK^--143细胞中挑选TK^-表型病毒,分别以相应的^(32)P标记的基因片段为探针进行杂交筛选重组病毒株。我们得到7株含K99亚单位基因的重组病毒V-K99(Ⅰ～Ⅷ),5株含K88亚单位基因的重组病毒V-K88(Ⅰ～Ⅴ);1株含LT-B亚单位基因的重组病毒V-LTB,ELISA检测结果表明,在以上3种重组病毒感染的人TK^--143细胞培养液和细胞裂解物中均未测出相应的基因表达产物。以上结果表明这3种基因可能不易在痘苗系统内有效表达。

4种方法预防仔猪黄、白痢试验效果观察

通过A、B、C、D4种方法对仔猪黄、白痢进行预防,结果表明:B、C、D3组比A组发病率分别减少51.73、61.33和64.81个百分点,死亡率分别降低8.91、14.13和18.26个百分点,差异极显著(P<0.01);B组仔猪平均断奶重高于A组10.69%,差异显著(P<0.05);C、D两组仔猪平均断奶重分别高于A组20.68%、21.24%,差异极显著(P<0.01);C、D两组的发病率均极显著地低于B组(P<0.01),C组死亡率比B组减少5.22个百分点,差异显著(P<0.05),D组死亡率比B组减少9.35个百分点,差异极显著(P<0.01);C、D两组仔猪平均断奶重高于B组9.02%、9.53%,差异均显著(P﹤0.05);D组的发病率、死亡率均显著低于C组(P﹤0.05),D组仔猪平均断奶重高于C组0.47%,但差异不显著(P﹥0.05);另外预防和治疗费用B、C、D3组分别比A组低1.04、0.71、0.64元/头,其中以B组费用最低,仅为0.09元/头。

产肠毒素大肠杆菌多重PCR检测方法的建立

为快速检测和鉴定产肠毒素大肠杆菌(ETEC)菌毛(K88和K99)和毒素(STa)基因,本研究设计合成了针对K88、K99和STa基因的3对特异性引物,对K88、K99和STa基因扩增条件进行优化,建立了检测K88、K99和STa的多重PCR方法。该方法对K88、K99和STa基因的扩增产物分别为237 bp,314 bp和166 bp;此外,该方法具有良好的灵敏性和特异性。本实验建立的多重PCR方法为致幼畜腹泻ETEC的检测提供了快速准确方法。用所建立的多重PCR方法对实验室分离的23株大肠杆菌进行检测,结果 2株为K99/STa阳性,1株为STa阳性。

产肠毒素大肠杆菌双重PCR检测方法的建立

为了快速检测和鉴定产肠毒素大肠杆菌菌毛(K88和K99)基因,本研究设计合成了针对K88、K99的2对特异性引物,对扩增条件进行优化,建立了检测K88和K99的双重PCR方法。该方法对K88、K99基因的扩增产物大小分别为237和314bp;最终确定dNTP终浓度0.4mmol/L,K88、K99的引物终浓度均为25μmol/L,退火温度为52℃。试验结果表明,该方法具有良好的灵敏性和特异性。用所建立的双重PCR方法对实验室分离的23株大肠杆菌进行检测,结果显示,K88单重PCR阳性2株,K99单重PCR阳性3株,K88和K99双重PCR阳性5株。本研究建立的双重PCR检测方法为致幼畜腹泻产肠毒素大肠杆菌的快速准确检测提供了方法。

基因工程大肠杆菌发酵的研究

基因工程菌的发酵工艺研究在生物高技术产业化的发展中具有重要的意义。研究结果表明，每１０Ｌ发酵液可得１～２ｋｇ湿菌体，发酵时间从一般的２４～３０ｈ缩短到６～８ｈ，５Ｌ、１５Ｌ、１５０Ｌ发酵罐都可得重复性的结果。这项发酵工艺研究不仅适用于Ｅ．ｃｏｌｉ各种不同类型的表达启动子的工程菌，也适用于野生菌株疫苗等的生产，将对我国基因工程产业化起重要作用。

大肠埃希氏菌表面菌毛黏附因子多价菌毛疫苗的研制

为了预防仔猪黄痢,选取ETEC野生分离菌株HN2001(K88ab)、HN2002(K88ac)、HN2003(K88ad)、HN2004(K99)、HN2005(987p)、HN2006(F41)培养后用低温磁力搅拌法提取到菌毛,制成5批多价菌毛混合油乳剂灭活苗,实验室试验结果表明,5批多价灭活疫苗对小白鼠的平均保护率达95.0%,为进一步进行田间试验提供了理论依据,并将为生产上防治仔猪黄痢提供一种保护范围更加全面的生物制品。