与绵羊KAP6-1相似的6个绒山羊全长cDNA的克隆与序列分析

用SMARTTM技术构建了绒山羊体侧部皮肤组织的cDNA文库 ,随机挑选克隆提取质粒 ,用M13正向测序引物对插入片段进行测序 ,得到 6 36个cDNA序列。与GenBank数据库比对 ,有 4 1个序列与绵羊角蛋白关联蛋白(KeratinAssociatedProtein ,KAP6 1)cDNA高度同源。 4 1个序列可归为 6个不同的cDNA ,GenBank登陆号分别为AY310 74 9、AY310 75 0、AY310 75 1、AY310 75 2、AY310 75 3和AY310 75 4。与绵羊KAP6 1基因组基因比较 ,推测这 6个序列为全长cDNA ,分别为编码 82、84、71、71、83和 83个氨基酸的碱性蛋白质 ,甘氨酸和酪氨酸的含量大于 6 0 % ,它们之间核苷酸序列的一致性大于 5 5 4 % ,读码框氨基酸序列的一致性大于 79 8%。与其他物种KAP6s比较 ,绒山羊的 6个cDNA和绵羊的KAP6 1cDNA的序列一致性最高 ,为 81 9%～ 98 8% ,不同物种KAP6 1之间氨基酸序列一致性大于 5 0 %。

拔毛·剃毛对绵羊皮肤中GHR·IGF-1·IGF-1R·KAP3.2和KAP6-1基因表达的影响

选取36只新疆细毛羊随机分成6组进行拔毛、剃毛处理,于第0、3、6、9、12、50天采集皮肤样品,用反转录多聚酶链式反应(RT-PCR)方法,定量分析绵羊皮肤中生长激素受体(GHR)、胰岛素样生长因子1(IGF-1)和胰岛素样生长因子1型受体(IGF-1R)、角蛋白关联蛋白KAP3.2和KAP6-1mRNA的相对丰度。实验结果显示,与对照组相比,剃毛可显著提高IGF-1的表达量,但对GHR、IGF-1R、KAP3.2和KAP6-1的表达量均无明显的影响;而拔毛对皮肤中GHRI、GF-1I、GF-1R、KAP3.2和KAP6-1基因表达均无明显影响。

绵羊角蛋白关联蛋白KAP6-1基因5′端调控区的分子克隆及测序结果比较

根据绵羊毛囊角蛋白关联蛋白(KAP 6-1)基因已知DNA序列设计合成了两个特异性引物,以绵羊基因组DNA为模板,PCR扩增出1 042 bp的特异性片段,连接到pM D 19T载体中获得该片段克隆.经过快速提质粒法筛选、限制性内切酶分析表明该克隆包含所需的目的片段.DNA测序结果也证明该克隆片段与原基因5′端调控区序列相比具有很高的一致性.研究结果为今后制备转基因克隆动物,在毛囊细胞中特异性表达绒毛生长调控基因奠定了基础.

牦牛KAP6-1和KAP6-4基因序列变异分析

角蛋白关联蛋白（keratin-associated proteins,KAPs）是毛纤维的主要结构成分。以甘南牦牛、青海牦牛、天祝白牦牛和野血牦牛为研究对象,应用PCR-SSCP方法检测KAP6-1和KAP6-4基因外显子序列多态性。结果表明4个牦牛群体的KAP6-1基因外显子区存在c.42T〉C、c.135C〉T的同义突变及c.173G〉C、c.175G〉T的非同义突变,导致p.Cys58Ser和p.Gly59Cys的氨基酸残基改变;另外检测到1处45 bp的插入/缺失突变导致16个氨基酸残基的插入/缺失;甘南牦牛PIC值0.222 3为低度多态,其他3个牦牛群体PIC值0.393 4~0.4672为中度多态。牦牛KAP6-4基因外显子区检测到c.51C〉T、c.54C〉A、c.78T〉C、c.96T〉C和c.135T〉C的同义突变,以及c.118A〉G的非同义突变,导致编码的氨基酸残基p.Ser40Gly的改变;4类群牦牛PIC值为0.2658~0.387 2为中度多态。聚类分析表明牦牛KAP6-1基因外显子区碱基序列与普通牛、绵羊和山羊的同源性最高,其亲缘关系和系统进化远近一致。

阿尔巴斯白绒山羊KAP6家族cDNA的特征分析

在构建内蒙古阿尔巴斯白绒山羊次级毛囊兴盛期皮肤组织cDNA文库的基础上 ,随机挑取 6 36个克隆从 5’端开始测序 ,对序列进行特征分析。分析结果表明有 4 1个ESTs与绵羊KAP6 - 1基因同源性大于 95 % ,且期望值小于le - 10 ,进一步分析可被分为 6个Clusters。从每个Cluster中挑取一个全长cDNA序列 ,其核苷酸序列和预测编码的蛋白质序列表明AY310 75 3与绵羊KAP6 - 1最为相似、AY310 75 0差别最大 ,AY310 75 1和AY310 75 2在编码区分别缺少 36个的核苷酸或 12个的氨基酸。

绵羊角蛋白Kap6.1启动子的克隆及活性检测

克隆绵羊角蛋白Kap6.1启动子,为下一步构建真核毛囊特异表达载体奠定基础。以绵羊基因组为模板,利用PCR方法克隆绵羊角蛋白结合蛋白Kap6.1启动子,并用此启动子置换真核表达载体pEGFP-N1的原始启动子CMV,构建pKap-EGFP质粒,通过转染内蒙古阿尔巴斯绒山羊胎儿皮肤成纤维细胞鉴定启动子活性。结果显示:克隆所获得的启动子序列与NCBI上发表序列匹配率为99.6%,启动子的特征序列CAAT框和TATA框完整,并且分别位于序列的921位和878位,pKap-EGFP质粒转染绒山羊成纤维细胞后Kap能启动GFP的表达,与对照组相比活性良好。本研究通过克隆获得了绵羊角蛋白结合蛋白Kap6.1启动子,并观测到其能启动GFP在山羊胎儿皮肤成纤维细胞中表达。

饲粮半胱氨酸水平对獭兔生产性能、氮代谢、毛皮品质及KAP6.1基因时序表达的影响

本研究旨在研究饲粮半胱氨酸水平对獭兔生产性能、氮代谢及毛皮品质和KAP6.1基因时序表达的影响。选取120只90日龄健康獭兔随机分为4组(每组30个重复,每个重复1只兔),对照组饲喂基础日粮,试验组饲喂基础饲粮中添加0.25%、0.35%、0.45%水平的半胱氨酸的试验饲粮,预饲期7d,正式期40d。结果,饲粮半胱氨酸水平0.25%、0.45%组末重显著高于0%、0.35%组(P<0.05)。饲粮半胱氨酸水平0.35%、45%组采食量(P<0.05)显著高于0%、0.25%组,对平均日增重、料重比无显著影响(P>0.05);半胱氨酸0.35%组食入氮、可消化氮极显著高于其他组(P<0.01),0.45%组的沉积氮显著高于对照组(P<0.05),对粪氮、尿氮、表观消化率、氮利用率、氮生物效价均无显著影响(P>0.05);饲粮半胱氨酸水平0.45%组处理40d皮张面积显著大于其余各组(P<0.05)。饲粮半胱氨酸水平0.45%、0.35%组处理30d被毛密度显著高于0%、0.25%水平组(P<0.05),对皮张厚度无显著性影响(P>0.05);饲粮半胱氨酸水平0.45%处理20d,KAP6.1基因在软骨、皮肤中表达量均显著高于其他组(P<0.05),而对处理10、30、40dKAP6.1基因在软骨、皮肤中表达量无显著影响(P>0.05)。综上所述,獭兔饲粮中半胱氨酸适宜添加量为0.45%,且110～120日龄使用效果最佳。