乙酰基转移酶KAT2A和Survivin蛋白乙酰化在食管癌中的相关性研究

目的 探讨食管癌组织中乙酰基转移酶2A(KAT2A)表达与Survivin蛋白乙酰化水平,分析二者在食管癌发生过程中的相关性。方法 选取70例食管鳞癌组织及其癌旁正常食管黏膜组织。实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测Survivin和KAT2A mRNA的表达,免疫组化及Western blotting检测Survivin和KAT2A的蛋白表达,免疫荧光验证Survivin和KAT2A在癌组织中的定位及表达;免疫共沉淀检测Survivin乙酰化。分析Survivin蛋白乙酰化与KAT2A的相关性及其二者与食管癌临床病理特征的关系。构建KAT2A RNA干扰序列,脂质体介导法转染至食管癌EC109细胞。应用qRT-PCR和Western blotting检测转染siRNA-KAT2A的食管癌EC109细胞中KAT2A mRNA和蛋白表达水平,免疫共沉淀检测EC109细胞中Survivin蛋白乙酰化水平。结果 食管癌组织中Survivin和KAT2A mRNA相对表达量高于癌旁组织(P<0.05);食管癌组织中Survivin和KAT2A蛋白呈高表达,而癌旁组织则呈低表达。免疫荧光证实Survivin和KAT2A蛋白在癌组织中同时呈现高表达状态,二者主要表达于细胞质中,部分表达于细胞核中。食管癌组织中Survivin蛋白发生了乙酰化,且食管癌组织中的乙酰化率显著高于癌旁组织(P<0.05);在食管癌组织中Survivin乙酰化和KAT2A表达呈正相关(r=0.517,P<0.05);Survivin乙酰化和KAT2A表达与食管癌的TNM分期、分化程度和淋巴结转移有关(P<0.05)。体外实验显示,RNA干扰下调KAT2A对食管癌细胞Survivin mRNA和蛋白表达量均无影响(P>0.05),但Survivin蛋白的乙酰化水平显著降低(P<0.05)。结论 在食管病变过程中KAT2A参与了Survivin乙酰化修饰,其高表达可能是Survivin乙酰化修饰重要的前期分子事件,在食管癌的诊治中具有潜在应用价值。

KAT2A通过Survivin乙酰化抑制Wnt/β-catenin通路调控食管癌的机制

目的探讨食管癌组织中KAT2A与Survivin蛋白乙酰化相关性及下调KAT2A对食管癌细胞Survivin乙酰化、Wnt/β-catenin通路及功能的影响。方法免疫共沉淀实验(Co-IP)检测蛋白乙酰化,免疫组化及Western blot法检测蛋白的表达。生物信息学预测乙酰基转移酶以Survivin为底物发生乙酰化的关系,免疫荧光验证蛋白在癌组织中的定位及表达;构建合成KAT2A小干扰RNA序列,脂质体介导法转染食管癌细胞,qRT-PCR检测mRNA的相对表达量,应用MTT、划痕愈合和Transwell小室实验检测细胞存活率、迁移和侵袭能力。结果免疫组化结果显示,食管癌组织中Survivin蛋白阳性率为71.11%(32/45),高于正常食管黏膜组织的28.89%(13/45);癌组织和正常食管黏膜组织中KAT2A蛋白阳性率分别为75.56%(34/45)和24.44%(11/45),差异有统计学意义(P<0.05)。Western blot结果显示,Survivin在癌组织中表达为(74.35±3.43)%,高于正常食管黏膜组织(22.62±2.48)%;KAT2A在癌组织中表达为(70.68±3.15)%,高于正常食管黏膜组织(23.87±2.67)%,差异有统计学意义(P<0.05)。食管癌组织中Survivin蛋白发生了乙酰化,其乙酰化率为(66.48±3.14)%,高于正常食管黏膜组织的(17.31±2.42)%,差异有统计学意义(P<0.05)。生物信息学预测显示:乙酰基转移酶KAT2A可以催化Survivin为底物发生乙酰化,且免疫荧光证实Survivin和KAT2A蛋白在癌组织中同时呈高表达,两者主要表达于细胞质中,部分表达于细胞核中;食管癌组织中Survivin乙酰化和KAT2A表达呈正相关(r=0.326,P=0.025);体外实验结果显示,KAT2A在食管癌EC109细胞中的阳性率为(87.36±4.24)%,高于正常食管上皮HEEC细胞的(17.45±2.78)%。食管癌EC109细胞内Survivin蛋白乙酰化水平为(87.79±4.12)%,显著高于正常食管上皮HEEC细胞中的(21.28±3.78)%。下调KAT2A后食管癌细胞内Survivin乙酰化水平显著下降,同时wnt3α、β-catenin和c-myc蛋白表达量下降,且抑制了细胞存活、迁移和侵袭能力。结论食管癌病变过程中乙酰基转移酶KAT2A高表达与Survivin蛋白乙酰化修饰具有相关性;KAT2A下调可使Survivin发生去乙酰化,并通过阻断Wnt/β-catenin信号通路影响食管癌细胞的功能。

大黄素调控组蛋白乙酰化促进HpG2肝癌细胞焦亡及凋亡的发生

目的 研究天然产物大黄素是否能够影响HpG2肝癌细胞中组蛋白乙酰化水平,进而加速肝癌细胞焦亡和凋亡,为肝癌的治疗提供新的靶点。方法 CCK-8法检测不同浓度大黄素对Hp G2细胞活力的影响;生物信息学分析TCGA数据库中肝癌患者组蛋白乙酰化相关基因表达情况,验证候选基因赖氨酸乙酰基转移酶2A(KAT2A)与细胞凋亡通路的相关性;实时荧光定量PCR(q PCR)检测Hep G2细胞与L02细胞KAT2A m RNA水平;酶联免疫吸附试验(ELISA)检测大黄素对Hp G2细胞中组蛋白乙酰转移酶(HAT)、组蛋白去乙酰转移酶(HDAC)、白细胞介素(IL)-1β、IL-18的影响;流式细胞术检测大黄素对肝癌细胞凋亡的影响;Western blot检测细胞凋亡、细胞焦亡相关蛋白B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)、Bcl-2-相关X蛋白质(Bax)、NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NLRP3)、胱天蛋白酶1(Caspase-1)、Gasdermin家族成员D N端(GSDMD-N)及KAT2A的表达情况。结果 大黄素能降低Hp G2细胞活性,半抑制浓度(IC_(50))95%置信区间为58.12~66.52μmol/L。与正常肝组织相比,组蛋白乙酰化相关基因m RNA水平在肝癌组织中表达增高,且KAT2A变化倍数最大[log_2(Fold Change)=2.010,P<0.01];在肝癌组织中,KAT2A m RNA的表达与细胞凋亡通路呈负相关(r_s=-0.230,P<0.01)。与L02细胞相比,KAT2A m RNA在Hep G2中表达升高(P<0.05);与对照组相比,大黄素干预组HAT和HDAC的表达水平下降,IL-18、IL-1β表达水平水平增高,细胞凋亡率升高,KAT2A、BAX的表达降低,Bcl-2、NLRP3、GSDMD-N及Caspase-1表达水平升高(P<0.05)。结论 大黄素可抑制肝癌细胞活力,加速细胞凋亡和焦亡,其机制可能与调控KAT2A表达相关。

人工改造甜瓜钾离子通道基因△KAT2/MIRK转拟南芥的生理特性分析

K＋通道是介导植物K＋吸收转运的主要途径之一。甜瓜K＋通道MIRK对外源Na＋敏感,生物信息学分析其敏感位点可能位于孔区外（即S5-P-S6）。为了验证MIRK受Na＋抑制位点,本研究将拟南芥中不受Na＋抑制的同源K＋通道基因KAT2孔道区替换到MIRK序列上,生成人工改造甜瓜K＋通道基因△KAT2/MIRK。电生理实验结果显示△KAT2/MIRK仍保持了MIRK介导K＋的属性,但其内向电流则不受外源Na＋的抑制。将MIRK和△KAT2/MIRK分别转化到拟南芥K＋通道KAT1突变体kat1中,抗性筛选和PCR检测结果表明成功获得p35S：：MIRK-kat1和p35S：：△KAT2/MIRK-kat1转基因植株。分别用50、100 mmol/L的Na Cl溶液处理转基因拟南芥和kat1突变体,发现MIRK及△KAT2/MIRK在kat1中的过表达可以介导K＋内流,并参与植株对盐胁迫的响应。