利用CRISPR/Cas9系统靶向敲除Jurkat T细胞Kcna3及其功能研究

为探究如何利用CRISPR/Cas9系统靶向敲除Jurkat T细胞Kv1.3通道编码基因Kcna3,以期阐明Jurkat T细胞中Kv1.3通道介导的病理生理功能,本研究设计Kcna3第一个外显子sgRNA,将构建的pX458-sgRNA重组质粒经电穿孔方式转染Jurkat T细胞,联合使用T7EN1酶切、基因组PCR产物和TA克隆测序、Western Blot检测以及电生理、钙成像和ELISA等功能检测技术鉴定Jurkat T细胞中Kcna3敲除效果.测序结果显示,靶向Kcna3基因CRISPR/Cas9重组质粒pX458-sgRNA建立成功,设计的sgRNA2可高效切割基因组DNA.Western Blot未检测出Kv1.3蛋白表达,基因组PCR产物及TA克隆测序显示发生Indel突变.全细胞膜片钳实验结果表明,Kcna3敲除成功的Jurkat T细胞未记录到Kv1.3通道电流,钙成像技术显示Kcna3敲除Jurkat T细胞内自由Ca^2+浓度上升的幅度显著低于野生型Jurkat T细胞.ELISA实验结果显示,与野生型Jurkat T细胞相比,Kcna3敲除Jurkat T细胞IL-2水平显著下降(P<0.001).本研究成功利用CRISPR/Cas9系统靶向敲除Jurkat T细胞Kcna3,有力证明Kv1.3介导了Jurkat T细胞的免疫炎症反应,为深入研究Kv1.3通道的病理生理功能提供了新的细胞模型.

丹红注射液联合瑞舒伐他汀抗冠状动脉粥样硬化的作用机制研究

目的明确丹红注射液联合瑞舒伐他汀在冠状动脉粥样硬化症患者中的药物作用机制。方法200例冠状动脉粥样硬化患者随机分为对照组(A组)、瑞舒伐他汀组(B组)、丹红注射液组(C组)、瑞舒伐他汀联合丹红注射液组(D组)。抽血各组患者血清并提取和分离淋巴细胞,分别采用流式细胞仪技术检测IFN-γ阳性淋巴细胞占T淋巴细胞总数的比率,采用Western-blotting法检测KCNA3蛋白表达,采用ELISA法检测血清TNF-α和oxLDL含量,采用生化分析仪检测血清TC、TG、LDL-c、HDL含量。结果B、C、D组血清中IFN-γ阳性淋巴细胞占T淋巴细胞总数的比率、TNF-a与A组相比较差异有统计学意义(P<0.05),D组与B组、C组相比较差异有统计学意义(P<0.05);在B、C和D组中HDL、TC、TG、oxLDL与A组相比较差异均有统计学意义(P<0.05),D组与B、C组相比较差异均有统计学意义(P<0.05);在B和D组中LDL-c水平与A组相比较差异有统计学意义(P<0.05);在B、C和D组中可见KCNA3蛋白表达均较A组降低,与A组相比较差异均有统计学意义(P<0.05);D组与B、C组相比较差异有统计学意义(P<0.05);B组与C组中所有检测指标相比较差异均无统计学意义(P>0.05)。结论丹红注射剂联合瑞舒伐他汀可以通过降低患者的血管内皮的炎症反应,降低患者的血脂水平,调节钾离子通道的敏感性,从而减轻血管内皮损伤,进一步改善患者血管的硬化程度,预防心律失常发生,有利于患者的临床症状改善及预后。