先天性长QT综合征KCNE1基因的克隆及其真核表达载体的构建

目的:克隆先天性长QT综合征KCNE1基因,并构建真核表达载体。方法:从人胎盘组织中提取总RNA,经逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增出KCNE1基因;采用T-A克隆法,将KCNE1基因克隆入pCR2.1 TOPO载体中,经限制性酶切基因重组后,构建真核表达载体pEGFP-N1-KCNE1,经DNA测序鉴定,用E ffectene转染试剂介导转染HEK293细胞。结果:采用基因克隆和重组法,得到了KCNE1真核表达载体pEGFP-N1-KCNE1,并在HEK293细胞中得到了表达。结论:KCNE1基因的克隆及其真核表达载体的构建和表达为进一步的功能研究奠定了基础。

人类KCNE1基因单核苷酸多态性与心律失常关系的研究

目的探讨中国汉族人群心肌钾离子通道β亚单位基因KCNE1的单核苷酸多态性(SNPs)与心律失常发生的关系。方法入选心律失常患者197例(病例组)及健康者104名(对照组),病例组根据基础疾病不同又分为心房颤动组(111例)、室上性心动过速组(52例)、室性心动过速组(34例)。采用聚合酶链式反应(PCR)方法扩增KCNE1基因编码区全部序列,直接行DNA测序以明确遗传变异类型,并进行统计分析研究。结果病例组与对照组均存在KCNE1-S38G多态性改变,两组基因型分布和等位基因频率存在一定差异,但无显著性。分组分析显示,室性心动过速组(包括特发性室性心动过速18例)基因型分布与对照组存在统计学差异(P＜0．05),A、G等位基因频率(45．6%和54．4%vs 26．9%和73．1%)相比差异显著(P＜0．01),基因型A/A、A/G与G/G型比较对室性心动过速的OR值分别为3．188(95%CI1．307～7．771)和3．500(95%CI 1．111～11．028)。分组比较各基因型间校正QT间期(QTc)等临床资料无显著差异。结论中国汉族人群中广泛存在KC- NE1-S38G单核苷酸多态性改变,室性心动过速组A等位基因频率明显高于对照组,该位点与室性心动过速有一定关联。

新疆地区哈萨克族心房颤动与钾离子通道KCNE1-G38S基因多态性的相关性

目的研究新疆地区哈萨克族心房颤动与钾离子通道KCNE1-G38S基因多态性的相关性。方法收集新疆地区哈萨克族房颤人群(房颤组)和非房颤人群(对照组)各100例的外周血样标本,提取DNA,经聚合酶链反应-限制性内切酶片段长度多态性(PCR-RFLP)、琼脂糖电泳法鉴定分析KCNE1-G38S基因型和等位基因分布。结果KCNE1-G38S基因AA、AG、GG基因型频率在房颤组分别为0.13(13/100)、0.34(34/100)和0.53(53/100),在对照组分别为0.10(10/100)、0.57(57/100)和0.33(33/100),两组基因型分布有显著性差异(P<0.05),且房颤组G等位基因频率(0.70)明显高于对照组(0.515)(P<0.001)。结论新疆地区哈萨克族心房颤动的发生与KCNE1-G38S基因多态性相关,KCNE1-G38S基因多态性位点可能存在种族、地区差异。

大鼠缺血心肌中KCNE1,KCNE2基因表达的变化

目的:研究大鼠缺血心肌中KCNE1,KCNE2基因表达变化情况,进一步探讨急性心肌梗死后并发心律失常的机制.方法:成功建立SD大鼠急性心肌梗死模型,通过RT-PCR、免疫印迹方法检测急性心肌梗死后24h及1,2,4wk梗死周边缺血心肌中KCNE1,KCNE2mRNA和蛋白质的水平,并观察各组室性心律失常的发生情况.结果:SD大鼠左室心肌中有KCNE1及KCNE2的表达,在急性心肌梗死后24h,无论是KCNE1还是KCNE2的mRNA和蛋白质表达在缺血心肌中均呈明显增加(P<0.05),并在1～2wk达到高峰,随后开始下降,4wk时KCNE1的mRNA、蛋白质水平和KCNE2的mRNA水平仍显著高于正常心肌中的表达(P<0.05).此外,心梗模型各组尤其是心肌梗死后1wk和2wk组室性心律失常明显多于假手术组.结论:急性心肌梗死后缺血心肌中KCNE1,KCNE2这两个离子通道基因表达的异常变化,可能对心肌细胞的自律性、兴奋性和传导性产生影响,成为梗死后心律失常产生的原因之一.

心肌钾离子通道β亚单位基因KCNE1多态S38G与心房颤动的关系

目的:探讨我国汉族人群心肌钾离子通道β亚单位基因KCNE1多态S38G与心房颤动(房颤)发生间的关系,并分析KCNE1-S38G在该人群中的分布特点。方法:入选房颤患者111例(病例组)及健康者101名(对照组),病例组根据基础疾病不同又分成4个亚组:孤立性房颤、高血压合并房颤、冠心病合并房颤及高血压冠心病合并房颤。采用PCR-DNA测序方法检测病例及对照组KCNE1基因编码序列,并进行统计分析。结果:病例组与对照组间,KCNE1-S38G的3种基因型频率为A/A(6.3%比11.9%)、A/G(36.9%比28.7%)、G/G(56.8%比59.4%)及A、G等位基因频率(24.8%和75.2%比26.2%和73.8%),其存在一定差异,但无显著性。各房颤亚组间比较也无显著差异。病例组各基因型间的校正QT间期(QTc)值无显著差异。结论:KCNE1-S38G在房颤患者中占一定优势,但与正常对照组相比无显著差别。KCNE1-S38G多态性位点可能存在种族、地区差异。

比索洛尔对急性心肌梗死大鼠梗死周边区心肌组织中KCNE1和KCNE2表达的影响

目的:观察急性心肌梗死(AMI)大鼠梗死周边区心肌组织中KCNE1和KCNE2mRNA和蛋白的表达及比索洛尔的干预作用。方法:40只AMI大鼠随机分为24h组、1周组、4周组和比索洛尔组(给药4周),同时设假手术组,每组10只。分别于各时间点处死大鼠,取左心室梗死周边区心肌组织,假手术组取对应部位的心肌组织,分别采用RT-PCR和Western blot检测KCNE1和KCNE2mRNA和蛋白的表达。结果:各组大鼠梗死周边区心肌组织中KCNE1和KCNE2mRNA和蛋白的表达相比,差异均有统计学意义(mRNA:F=130.418和182.943,蛋白:F=425.815和619.624,P<0.001);梗死后24h,梗死周边区心肌KCNE1、KCNE2mRNA和蛋白的表达逐步增加(P<0.05),在1周时达到高峰,4周时4周组和比索洛尔组KCNE1和KCNE2mRNA和蛋白的表达仍高于假手术组,但比索洛尔组低于4周组(P<0.05)。结论:比索洛尔可抑制AMI后梗死周边区心肌组织KCNE1和KCNE2表达的上调,可能是其抗心律失常的机制之一。

KCNE1基因G38S多态性与新疆维吾尔族射血分数减少型慢性心力衰竭的关联性

目的研究KCNE1基因G38S多态性与新疆维吾尔族慢性心力衰竭(CHF)的关联性。方法采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)对新疆维吾尔族200例CHF患者(病例组)和200例无CHF患者(对照组) KCNE1基因G38S(rs1805127)多态性进行分析。结果 KCNE1基因mink G38S多态性AA、AG、GG基因型在病例组为24(12. 0%)、89(44. 5%)和87(43. 5%),对照组分别为37(18. 5%)、91(45. 5%)和72(36. 0%)。等位基因A、G频率在病例组分别为137(34. 2%),263(65. 8%),对照组分别为165(41. 2%),235(58. 8%)。两组之间基因型无统计学差异(χ2=4. 208,P=0. 122),两组的等位基因频率有统计学意义(P <0. 05)。经二分类logistic回归分析左室舒张末内径的OR值为1. 473,95%CI:(1. 357~1. 599),QRS时限OR值为1. 028,β=0. 027,95%CI:(1. 009~1. 047),性别OR值为2. 288,β=0. 828,95%CI:(1. 059~4. 943),冠心病的OR值为3. 047,β=1. 114,95%CI:(1. 532~6. 063),糖尿病OR值为3. 200,β=1. 163,95%CI:(1. 345~7. 562)。基因型AG的OR值为0. 489,β=-0. 715,95%CI:(0. 247~0. 966)。结论 (1)维吾尔族CHF患者中KCNE1基因G38S携带G等位基因频率高于对照组(无CHF患者);(2)左室舒张末径增加、QRS波时限延长、男性、冠心病、糖尿病均是CHF的危险因素,携带AG基因型的维吾尔族人群发生CHF的风险小,基因型AG可能为CHF的保护因素。

KCNE1胞外N段功能的研究

目的:研究电压依赖性钾离子通道-IKs通道的调节亚基KCNE1胞外肽段(氨基端肽段,简称N段)的功能,探究胞外N段在KCNE1调控IKs通道中的作用。方法:通过分子生物学技术制备KCNE1的N段缺失突变体;利用Western Blot方法了解突变体的蛋白表达情况;以细胞免疫染色方法观察突变体的亚细胞定位情况;以全细胞膜片钳记录技术检测突变体(与KCNQ1共表达)的通道电流特征。结果:成功构建KCNE1胞外N段缺失的突变体KCNE1-ΔN,突变体体外表达正常;与野生型相比:KCNE1-ΔN在细胞内的分布出现蛋白集聚现象;通道的电流密度减小,激活电压相比较出现了明显的左移,即通道的激活速率变快。结论:KCNE1的N段对其蛋白表达无明显影响,但对蛋白的转运起重要作用;N段参与了KCNE1对通道电流大小的调节,以及对通道激活特征的调控。

N-糖基化对KCNE1功能的影响

目的:探究N-糖基化在KCNE1功能中的作用。方法:根据N-糖基化序列特征"Asn-X-Ser/Thr"分析和N-糖基化特异消化酶实验检测KCNE1是否存在N-糖基化,通过点突变构建N-糖基化位点突变体并通过蛋白质印迹法检测其蛋白表达,细胞免疫荧光染色检测突变体亚细胞定位;免疫共沉淀检测突变体与KCNQ1的相互作用。结果:KCNE1存在N-糖基化,N5和N26是其可能位点;点突变获得KCNE1-N5Q、KCNE1-N26Q和KCNE1-N5,26Q 3个突变体。蛋白质印迹法确定N5和N26为KCNE1的两个糖基化位点;与野生型相比,突变体在细胞内呈现不同程度的蛋白囤积现象,KCNE1-N26Q表现尤为显著,KCNE1-N5,26Q和KCNE1-N5Q则表现略轻;KCNE1 N-糖基化突变体仍能与KCNQ1结合。结论:N-糖基化在KCNE1转运中发挥重要作用,其中N26较为关键;N-糖基化在KCNE1与KCNQ1之间的相互作用中不起重要作用。

KCNE1、KCNE2基因多态性与家族性房颤的相关性

目的探讨KCNE1、KCNE2基因多态性与家族性房颤的相关性。方法选择房颤患者62例,其中家族性房颤39例,非家族性房颤23例,另选择健康体检者30例作为对照组。采用PCR测定KCNE1基因rs1805127位点和KCNE2基因rs1805120位点多态性分布情况。结果家族性房颤组和非家族性房颤组KCNE1基因rs1805127位点A等位基因分布率明显低于对照组,而G等位基因分布率明显高于对照组,差异均有统计学意义(P<0.05);而家族性房颤组和非家族性房颤组KCNE1基因rs1805127位点A等位基因和G等位基因分布率比较无明显差异(P>0.05)。家族性房颤组和非家族性房颤组KCNE1基因rs1805127位点GG基因型分布率明显高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);而家族性房颤组和非家族性房颤组KCNE1基因rs1805127位点GG基因型分布率比较无明显差异(P>0.05)。各组KCNE2基因rs1805120位点C和T等位基因分布率比较无明显差异(P>0.05)。各组KCNE2基因rs1805120位点CC、CT和TT基因型频率比较无明显差异(P>0.05)。结论家族性房颤与KCNE2基因位点rs1805120多态性无明显相关性,与KCNE1基因rs1805127多态性具有相关性,并且认为其携带等位基因G可能为家族性房颤易感基因。

KCNE1基因与孤立性心房颤动的关系

目的 探讨KCNE1基因与孤立性心房颤动的关系。方法 随机收集 94例孤立性心房颤动患者(病例组 )和 130名无血缘关系的健康者 (对照组 ) ,采用PCR直接测序的方法测定KCNE1序列。在获得G116A多态性的基础上 ,采用关联研究分析KCNE1基因型与心房颤动表现型的关系。结果 病例组和对照组GA、GG和AA基因型的差异无显著性 (GA :4 8对 37,GG :72对 5 4 ,AA :10对 3;χ2 =1.5 6 8,P >0 .0 5 )。结论 KCNE1基因与孤立性心房颤动的发病无关。

广西壮族人群KCNE1基因多态性与心房颤动的关系研究

目的:研究广西壮族人群心房颤动(AF)发生与KCNE1基因rs1805127多态性的关系。方法:选取广西医科大学第一附属医院心胸外科2018年1—12月收治的102例AF患者(观察组)和同期接受体检中心体检服务的100例窦性心律正常人员(对照组)作为研究对象。通过直接测序得出KCNE1基因rs1805127基因型和等位基因频率分布,分析KCNE1基因rs1805127基因型、等位基因频率分布与AF发生的相关性。结果:KCNE1基因rs1805127在观察组及对照组中的多态分布状况比较,差异无统计学意义(P>0.05);KCNE 1基因的rs1805127等位基因频率分布比较,观察组携带G等位基因的群体比例更高(P<0.05);对照组中AA基因型和G等位基因携带者左房内径(LA)及左室射血分数(LVEF)比较,差异均无统计学意义(均P>0.05)。结论:KCNE1基因rs1805127的G等位基因可能是广西壮族人群AF发生的危险因子,其可能增加AF发生的风险。

新疆维吾尔族和汉族KCNE1、KCNE4基因多态性与房颤的相关性研究

目的探讨新疆维吾尔族和汉族KCNE1基因rs1805127、KCNE4基因rs12621643位点多态性与房颤的相关性。方法采用病例一对照研究，纳入房颤患者852例（其中维吾尔族409例，汉族443例）。按照与病例组民族和性别相同、年龄相同或相近的原则，以1：1比例选出对照。提取外周血DNA，应用聚合酶链反应一限制性片段长度多态性方法鉴定基因型。结果维吾尔族人群KCNEl（rs1805127）多态是患房颤的独立风险因素之一。汉族人群KCNE1（rs1805127）与房颤的患病无关。维吾尔族和汉族人群KCNE4（rs12621643）多态是房颤的独立风险因素。维吾尔族房颤阻塞性睡眠呼吸暂停综合征病史、肥胖、高血压、胆固醇、血同型半胱氨酸（homocysteine，Hcy）、超敏C反应蛋白（hypersensitive C-reactiveprotein，hs-CRP）、白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、KCNE1（rs1805127）和KCNE4（rs12621643）的调整人群归因风险度（populationattributableriskpercentage，PARc）分别是9．68％、12．06％、15．76％、6．91％、11．37％、17．78％、9．31％、11．27％和6．46％。汉族房颤饮酒、高血压、胆固醇、Hcy、hs—CRP、IL-6和KCNE4（rs12621643）的PARc分别是12．94％、14．48％、7．24％、8．49％、17．29％、9．49％和7．41％。结论新疆维吾尔族、汉族KCNE1（rs1805127）与房颤的关系存在差异，维吾尔族人群KCNE1（rs1805127）与房颤相关。KCNE4（rsl2621643）与房颤的关系无民族差异。维吾尔族和汉族人群KCNE4（rs12621643）均是房颤患病的独立风险因素。在不同民族的人群中，根据“风险基因”选择重点人群进行可控风险因素的控制，对防治房颤具有一定作用。

多脏器功能衰竭犬室性心律失常与KCNE1关系的研究

目的:探讨多脏器功能衰竭(MODS)犬室性心律失常的发生与KCNE1基因的关系。方法:选择健康杂种犬14只,雌雄不限。随机分为MODS模型组7只,对照组7只。实验组失血性休克复苏后静脉注射内毒素形成"二次打击"制作犬MODS模型。当MODS犬发生室性心律失常,抢救无效死亡后,迅速取出犬的心脏,剪下犬的左心室,置于液氨中固定,后转移至-80℃冰箱中保存。提取总RNA,反转录为cDNA。采用实时荧光定量聚合酶反应(qRT-PCR)法和蛋白免疫印迹(Western blot)方法检测左心室KCNE1基因在mRNA和蛋白质水平的表达,研究MODS犬室性心律失常与KCNE1的关系。结果:与对照组相比,MODS模型组KCNE1的mRNA和蛋白质表达水平显著降低(P<0.05)。结论:KCNE1与室性心律失常的发生具有相关性,其低水平表达可能是引起MODS犬发生室性心律失常的重要因素。

化合物QO-58对KCNQ1/KCNE1/IKs通道电流调节作用的研究

慢激活延迟整流钾电流(slowly activated delayed rectifier potassium current,IKs)由KCNQ1通道与KCNE1通道共同编码。KCNQl或KCNEl通道电流功能上调能够引发短QT综合征。全新化学结构化合物QO-58对KCNQ1-5通道具有开放作用。该文采用电生理膜片钳技术探讨QO-58对KCNQl/KCNEl/IKs通道电流作用,观察QO-58的心脏电生理毒性。结果表明,化合物QO-58能够浓度依赖性地增大KCNQ1/KCNE1通道电流,并且引起KCNQ1/KCNE1通道电流电压关系曲线向超极化方向移动。QO-58能够轻微增大豚鼠心室肌IKs通道电流,但对豚鼠乳头肌动作电位时程无显著影响。结果提示,QO-58心脏电生理毒性较低,具有进一步研发成为治疗兴奋性增强等相关疾病的新型药物的潜力。

急性运动对小鼠心肌KCNE1表达的影响

目的探讨急性游泳运动对小鼠心肌电压依赖性钾离子通道E家族成员1(KCNE1)表达水平的影响。方法雄性BALB/c小鼠42只,随机分7组,每组6只。非运动为对照组,余6组于急性游泳运动30min后即刻(A组)、1h(B组)、3h(C组)、6h(D组)、12h(E组)和24h(F组)取心肌组织;用RT-PCR和Westernblot技术分别检测各组小鼠心肌KCNE1的表达水平。结果与对照组相比,A、C和D组心肌KCNE1表达水平明显升高(P<0.05)。结论急性运动引起心肌KCNE1表达水平一过性升高,可能是交感紧张增强后心脏电生理活动发生改变的原因之一。

新疆维吾尔族老年人群延迟整流型钾离子通道KCNE1(G38S)基因多态性与心房颤动的相关性研究

目的探讨新疆维吾尔族老年人群延迟整流型钾离子通道KCNE1(G38S)基因多态性与心房颤动(AF)的相关性。方法收集新疆地区维吾尔族AF人群(AF组)和非AF人群(对照组)各70例的外周血样标本,提取DNA,采用等位基因聚合酶链反应(PCR-RFLP)的方法鉴定KCNE1(G38S)的基因型及等位基因分布。采用Logistic回归分析各种因素与房颤的相关性。结果 KCNE1基因G38S位点AA、AG、GG基因型频率在AF组分别为17.14%、27.14%、55.71%。在对照组分别为24.29%、50%、25.71%。2组基因型分布差异具有统计学意义(P<0.05),且AF组G等位基因频率明显高于对照组(P<0.05)。Logistic回归分析结果显示KCNE1(G38S)GG基因型与维吾尔族人群AF的发生相关(P<0.05)。结论新疆地区维吾尔族人群AF的发生与KCNE1(G38S)基因多态性相关。G38S位点多态性可能是维吾尔族AF患者的独立危险因素之一。

贵州省少数民族与汉族人群心房颤动患者KCNE1(D85N)和KCNE4(E145D)基因单核苷酸多态性研究

目的:探讨KCNE1(D85N)和KCNE4(E145D)基因单核苷酸多态性与贵州少数民族、汉族心房颤动(AF)发生的关联性。方法:收集贵州地区少数民族聚居地区AF患者185例作为病例组,健康成年人192例为对照组,检测各人群的KCNE1(D85N)和KCNE4(E145D)基因型、等位基因分布特点,结合临床资料分析各因素与AF的相关性。结果:AF与KCNE1(D85N)基因多态性无关(P>0.05),但与KCNE4(E145D)基因多态性有关(P<0.05),排除相关影响因素行logistic回归分析发现,KCNE4(E145D)基因多态性与贵州少数民族AF发生有显著关联,携带GG基因型可能是贵州少数民族人群发生AF的危险因素,而携带TT基因型可能是贵州少数民族和汉族人群发生AF的保护因素。结论:贵州地区少数民族和汉族AF发生可能与KCNE4(E145D)基因多态性有关。

KCNE1亚基对Cav1.2电流的调节及门控机制

目的探讨KCNE1对Cav1.2电流的调节及门控机制。方法采用瞬时转染的方法,将Cav1.2通道质粒单独或与KCNE1质粒共同转入HEK293细胞上,实验分Cav1.2组和Cav1.2+KCNE1组(每组取15个细胞),采用全细胞膜片钳技术记录Cav1.2电流和门控动力学。结果KCNE1与Cav1.2共同转染后,Cav1.2电流显著降低。在0mV时,Cav1.2峰电流密度从(-14.8±2.5)pA/pF降为(-7.5±1.6)pA/pF(n=15,P<0.01)。门控机制研究发现,KCNE1对Cav1.2电流的调节主要是使通道稳态失活曲线向更负的方向移动,进而加速失活;同时,也使通道失活后恢复减慢,失活时间常数延长,两方面共同作用导致电流密度的降低。结论KCNE1亚基可以通过改变Cav1.2通道稳态失活和失活后恢复过程降低其电流密度。

血管内皮生长因子165对HEK293细胞KCNQ1/KCNE1电流的影响及其机制研究

目的探讨血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)165对KCNQ1/KCNE1电流的影响及其可能机制。方法 HEK293细胞分为对照组、KCNQ1/KCNE1/KDR组和KCNQ1/KDR组,对照组细胞正常培养、不做处理,KCNQ1/KCNE1/KDR组细胞转染含KCNQ1、KCNE1和KDR基因的质粒,KCNQ1/KDR组细胞转染含KCNQ1和KDR基因的质粒,转染后48h,采用PCR法检测转染是否成功。KCNQ1/KCNE1/KDR组和KCNQ1/KDR组HEK293细胞加入100μg/L VEGF165处理10min,采用全细胞膜片钳技术记录处理前、后2组标准化激活电流和标准化尾电流的变化情况,并进行比较。结果 KCNQ1/KCNE1/KDR组和KCNQ1/KDR组细胞均成功转染;-20、0、20、40、60mV电压下,KCNQ1/KCNE1/KDR组处理后标准化激活电流(0.045±0.050、0.166±0.060、0.342±0.050、0.551±0.080、0.742±0.100)和标准化尾电流(0.049±0.040、0.154±0.090、0.346±0.090、0.572±0.080、0.751±0.100)均明显低于处理前(0.081±0.070、0.238±0.100、0.459±0.090、0.758±0.580、1.000±0.000,0.069±0.040、0.245±0.080、0.509±0.090、0.787±0.060、1.000±0.000)(P<0.05);-20、0、20、40、60mV电压下,KCNQ1/KDR组处理后标准化激活电流和尾电流与处理前比较差异均无统计学意义(P>0.05)。结论VEGF165能直接抑制KCNQ1/KCNE1电流,该作用通过β亚基发挥作用,由VEGF受体-2介导。