KCNH6基因肝脏特异性敲除小鼠的构建及其初步应用

目的构建KCNH6基因肝脏细胞特异性敲除小鼠,并监测其肝脏血脂变化。方法运用Cas9技术构建KCNH6 flox/flox转基因小鼠,将其与肝脏细胞特异性表达Cre重组酶工具鼠(Alb-cre)进行杂交,采用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)方法鉴定基因型。监测基因敲除小鼠和同窝对照小鼠的体质量和进食量。分别检测8周和20周雌雄各两组小鼠的三酰甘油、胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇。结果成功构建KCNH6基因肝脏细胞特异性敲除小鼠,其基因型为KCNH6 flox/flox/Cre T。与同窝对照组相比,基因敲除小鼠的体质量和进食量均无明显变化。8周雄性和雌性小鼠的血脂无明显变化。20周时雄性小鼠的胆固醇、三酰甘油和低密度脂蛋白胆固醇均有明显升高。结论成功构建了KCNH6基因肝脏细胞特异性敲除小鼠动物模型,成年雄性小鼠存在肝脏血脂代谢异常。动物模型的构建为探讨KCNH6基因在肝脏脂代谢中的作用提供重要研究平台。

Kcnh6点突变单基因糖尿病家系的小鼠模型构建及表型分析

目的通过CRISPR/Cas9技术构建Kcnh6基因P235L位点基因敲入定点突变小鼠模型,并验证该突变能否成功复制人类糖尿病家系表型,为接下来研究Kcnh6基因在糖尿病发病中的作用提供更精确的实验工具。方法设计针对已知糖尿病家系点突变位点的sgRNA(small guide RNA,sgRNA),同时制作一个携带靶位点同源臂、突变位点序列的供体DNA敲入载体。将sgRNA、cas9 mRNA和敲入载体通过显微注射移入小鼠的受精卵,选取其中存活的受精卵将其移植入假孕小鼠子宫,繁育得到子代小鼠。采用聚合酶链反应和基因测序等方法检测子代小鼠Kcnh6基因碱基突变情况。监测基因敲入小鼠的体质量和并对小鼠做糖耐量和胰岛素分泌实验。结果成功构建Kcnh6-P235L位点基因敲入纯合子小鼠。在高脂饲料喂养条件下,与同窝野生型(wild type,WT)小鼠相比,Kcnh6基因插入(knock in,KI)点突变小鼠的体质量增加,糖耐量及胰岛素分泌功能受损。结论成功构建了Kcnh6基因点突变敲入小鼠模型,且此模型具有糖尿病相关表型。

胰岛素分泌的双开关:KCNH6的促胰岛素分泌作用

以往认为,使用60年的经典降糖老药磺脲类药物作用于体内的胰岛素"开关",即胰岛β细胞去极化钾通道KATP,从而促进胰岛素分泌。我们的研究发现,体内胰岛素分泌还受胰岛β细胞复极化钾通道KCNH6的调节。本项目从一个大型四代糖尿病家系入手,发现该家系同时存在新生儿低血糖与成年糖尿病。该家系KCNH6钾通道基因突变与新生儿低血糖与成年糖尿病共分离。有趣的是,KCNH6基因敲除(KO)或点突变人源化敲入(KI)小鼠的糖尿病表型特征与该家系糖尿病人一致。经过近10年的研究,揭示了KCNH6对胰岛素分泌至关重要,提出了胰岛素分泌"双开关"控制理论。研究成果发表在2018年末的Cell子刊Cell Reports上。