KCTD9多肽抗体的制备和应用

目的:利用人工合成多肽制备针对人源、鼠源KCTD9(hKCTD9、mKCTD9)的特异性多克隆抗体,以期用于与KCTD9表达异常密切相关疾病的研究和诊治。方法:根据hKCTD9、mKCTD9基因编码的氨基酸序列合成多肽(Pep),并用化学方法与匙孔血蓝蛋白(KLH)连接,纯品Pep-KLH免疫纯种新西兰雄性大白兔,所制备的抗血清用ELISA、Western blot实验鉴定,并采用免疫组化法应用于正常人和乙型肝炎患者肝组织中hKCTD9的检测。结果:ELISA检测表明,用Pep-KLH免疫的大白兔所制备的抗血清可与Pep发生特异性免疫反应;Western blot结果显示,抗血清可识别MHV-3感染BALB/cJ小鼠PBMC特异性条带,相对分子质量(Mr)为37 kD。对正常人和病毒性乙型肝炎患者肝组织免疫组织化学染色发现hKCTD9在正常人和重型乙型肝炎患者均有表达,但是在重型乙型肝炎患者高表达。结论:所制备的KCTD9的多肽抗体(多克隆抗体)可识别mKCTD9和hKCTD9分子,具有与抗原特异性结合,为深入研究这一新发现的分子提供了有力的科学手段。

KCTD9蛋白在重型乙型肝炎中的表达及其意义

目的研究KCTD9蛋白在各型乙型肝炎中的表达并初步探讨其在人重型乙型肝炎中的作用机制。方法免疫组织化学检测KCTD9蛋白在慢性乙型肝炎肝组织和外周血单个核细胞（PBMC）中的表达；免疫荧光标记、激光扫描共聚焦显微镜进行亚细胞定位，荧光实时定量PCR检测KCTD9 mRNA在各型慢性乙型肝炎患者PBMC中的表达水平。结果35名健康志愿者和30例慢性乙型肝炎轻、中度患者中分别有14例和20例PBMC中可见阳性细胞，阳性细胞占总细胞数的0～12％和0～18％；47例重型乙型肝炎患者PBMC中均可见KCTD9蛋白的表达，阳性细胞占5％～75％。40例慢性乙型肝炎轻、中度患者中仅3例于肝组织坏死灶中偶见阳性细胞，健康对照者肝组织中偶见阳性细胞，39例重型乙型肝炎肝组织标本中均见KCTD9蛋白高表达，主要在肝细胞、胆管上皮细胞、库普弗细胞和炎症浸润细胞中。免疫荧光标记、激光扫描共聚焦显微镜检测结果表明，健康志愿者和慢性乙型肝炎轻、中度患者PBMC中KCTD9蛋白主要位于细胞质，而重型乙型肝炎患者PBMC胞质和胞核中均有表达。14例慢性重型乙型肝炎患者中5例PBMC KCTD9 mRNA显著升高，与其他组比较，差异有统计学意义（P〈0．05），升高表达的KCTD9 mRNA与血清ALT、AST、总胆红素、直接胆红素呈正相关，与白蛋白呈负相关。结论KCTD9 mRNA在肝脏和PBMC中的表达与病情严重程度呈正相关。KCTD9蛋白在病毒严重感染状态从PBMC的细胞质向细胞核内转移，提示其可能参与免疫细胞核内多种基因的调控。

KCTD9在暴发性肝炎小鼠中的作用机制初探

目的初步探讨KCTD9在暴发性肝炎模型小鼠中的作用机制。方法78只BALB／cJ小鼠（其中雄性6只）随机分为暴发性肝炎对照组和暴发性肝炎模型组，每组39只（每组雄性3只）；75只C3H／HeJ雌性小鼠分为慢性肝炎对照组（36只）和慢性肝炎模型组（39只）。模型组每只小鼠腹腔注射MHV-3（100PFU）。暴发性肝炎对照组和模型组48h试验点以1只雄性小鼠供取睾丸，2只雌性小鼠供取肝脾等组织标本和分离肝细胞，10只雌性小鼠为1个单位取肝组织供分离肝脾淋巴细胞；慢性肝炎对照组和模型组48h时以1只小鼠供取肝脾组织，1只小鼠供分离肝细胞，10只为1个单位供分离肝脾淋巴细胞，重复3次，剩下3只小鼠在建模15d时处死，仅供取肝脾组织。磁珠分选肝脾单个核细胞，采用免疫组织化学、实时定量PCR技术检测KCTD9在暴发性肝炎、慢性肝炎模型动物中的表达差异，各组间比较用f检验或方差分析。结果与对照组比较，KCTD9mRNA在暴发性肝炎模型组小鼠肝CD8＋T细胞、CD4＋T细胞、自然杀伤细胞（NK）细胞中分别上调8．8倍、59．4倍、577．1倍，f值分别为-5．393、-3．706和-4．714，P值均〈0．05，差异有统计学意义；在脾CD4＋T细胞、CD8＋T细胞中，KCTD9mRNA表达水平分别下调了43％和69％，t值分别为2．906、10．98，P值均〈0．05，差异有统计学意义。与对照组比较，在慢性肝炎模型组小鼠肝NK细胞和CD4＋T细胞中KCTD9mRNA分别下调71％、51％，t值分别为3．827、5．746，P值均〈0．05，差异有统计学意义。KCTD9蛋白在暴发性肝炎模型组小鼠肝细胞中呈弱阳性表达，坏死灶周围及组织中炎症浸润细胞中呈强阳性表达；脾中阳性细胞仍散在分布，与对照组比较，脾白髓中细胞数量减少达71％。结论KCTD9在MHV-3诱导的暴发眭肝炎模型小鼠肝脏高表达，可能参与疾病发生和发展过程。