利用酵母双杂交系统筛选与辣椒轻斑驳病毒126 kDa蛋白互作的辣椒寄主因子

【目的】辣椒轻斑驳病毒(pepper mild mottle virus,PMMoV)是世界范围内危害辣椒的主要病毒之一。126 kDa蛋白是PMMoV编码的重要致病因子,但致病机制目前仍不清楚。本研究旨在筛选与126 kDa蛋白互作的辣椒寄主因子,为解析PMMoV的致病机制提供理论依据。【方法】首先,通过同源重组法构建诱饵载体pGBK-126 kDa;并以辣椒叶片为试验材料,利用Trizol法提取辣椒叶片总RNA,制备辣椒酵母cDNA文库;之后,使用pGBK-126 kDa对cDNA文库进行筛选,并通过NCBI和Uniprot等对筛选结果进行序列比对和生物信息学功能分析,根据比对分析结果,选取可能参与到植物抗病通路的寄主因子,克隆其全长CDS构建到pGADT7载体,酵母双杂交(Y2H)、双分子荧光互补(BiFC)和荧光素酶互补(LCI)进一步验证126 kDa与寄主因子之间的互作;最后,通过瞬时过表达寄主蛋白分析其在PMMoV侵染过程中的作用。【结果】提取获得高质量辣椒RNA,无降解;获得高质量酵母cDNA文库,成功构建诱饵质粒pGBK-126 kDa,筛选得到与126 kDa蛋白互作的辣椒寄主因子18个;生物信息学分析结果显示,18个寄主因子广泛参与到植物酶系统、物质及能量代谢调节过程、DNA结合转录过程、激素合成过程以及防御响应等多个通路;选取的其中3个寄主因子(LA2、PDHE1、BXL1)在一对一酵母双杂交互作验证中均存在与126 kDa的相互作用,表明初筛的结果可靠;通过BiFC和LCI进一步验证了126 kDa与BXL1之间体内外互作;瞬时过表达BXL1发现PMMoV的侵染受到了显著抑制。【结论】成功构建了pGBK-126 kDa诱饵质粒,基于该质粒对酵母cDNA文库进行筛选得到18个互作的寄主因子,广泛涉及植物生命活动过程中的多个通路,筛选结果验证可靠,其中,BXL1存在与126 kDa的体内外相互作用,并能够抑制PMMoV的侵染。研究结果可为深入探究PMMoV的侵染机制提供良好的理论和材料基础。

缺氧诱导因子1α、Bcl-2/腺病毒E1B19kDa相互作用蛋白3在儿童创伤性脑损伤中的表达及意义

目的动态观察缺氧诱导因子1α(hypoxia-inducible factor 1α,HIF-1α)、Bcl-2/腺病毒E1B19kDa相互作用蛋白3(Bcl-2/adenovirus E1B19kDa-interacting protein 3,BNIP3)在儿童创伤性脑损伤(traumatic brain injury,TBI)中的变化,并评估其预测儿童TBI病情轻重及预后的临床价值。方法前瞻性纳入2021年1月—2023年7月47例中重度TBI患儿为研究对象,根据格拉斯哥昏迷评分分为中度亚组(9~12分)和重度亚组(3~8分);以同期因腹股沟斜疝诊治且无基础疾病的30例患儿为对照组。比较各组HIF-1α、BNIP3、自噬相关蛋白Beclin-1及S100B水平的差异,采用受试者操作特征曲线(receiver operating characteristic curve,ROC曲线)评估HIF-1α、BNIP3、Beclin-1及S100B对TBI病情轻重及预后的预测价值。结果TBI组患儿血清HIF-1α、BNIP3、Beclin-1、S100B水平高于对照组(P<0.05);TBI患儿中,重度亚组HIF-1α、BNIP3、Beclin-1、S100B水平高于中度亚组(P<0.05)。相关性分析显示,血清HIF-1α、BNIP3、Beclin-1、S100B水平与格拉斯哥昏迷评分呈负相关(P<0.05)。治疗7 d后,非手术TBI和手术TBI患儿的血清HIF-1α、BNIP3、Beclin-1及S100B水平均较治疗前下降(P<0.05)。ROC曲线分析显示,血清HIF-1α、BNIP3、Beclin-1、S100B水平预测重度TBI的曲线下面积分别为0.782、0.835、0.872、0.880(P<0.05),预测TBI预后不良的曲线下面积分别为0.749、0.775、0.814、0.751(P<0.05)。结论TBI患儿血清HIF-1α、BNIP3及Beclin-1水平显著升高,检测其水平有助于临床判断TBI患儿的病情轻重及预后。

智媒时代虚拟偶像的国际传播力研究——以英雄联盟 KDA 女团为例

在智媒时代,移动互联网、大数据、人工智能等技术深度嵌入信息传播,在此背景下诞生的英雄联盟虚拟偶像团体 KDA 以女团歌手身份“出道”,并推出音乐作品。作为由美国拳头游戏公司打造的虚拟形象,其对新型国际传播带来的启示值得研究。文章对相关概念进行梳理,从不同维度分析虚拟偶像团体 KDA 女团具有强大传播力的原因,并探讨虚拟偶像助力新型国际传播的可行性。

日本血吸虫中国大陆株23kDa膜蛋白核酸疫苗对猪免疫保护作用的研究

目的 研究日本血吸虫中国大陆株 2 3k Da膜蛋白 (Sj C2 3) DNA疫苗诱导猪的保护性免疫作用。方法 构建并大量制备 pc DNA3.1- Sj C2 3质粒 DNA和 pc DNA3.1- p35 ,pc DNA3.1- p40(小鼠 IL - 12的 2个亚单位 )的 DNA疫苗。 30头 2 .5月龄的上海松江本地猪 (阉猪 )分为 A、B、C3组 ,每组 10头。 A组 (Sj C2 3组 )于每头猪两侧臀部肌肉注射 5 0 0 μg pc DNA3.1- Sj C2 3质粒 DNA,B组 (Sj C2 3+IL- 12组 ) ,于每头猪肌肉注射 5 0 0 μg pc DNA3.1- Sj C2 3DNA及 5 0 0 μg pc DNA3.1- p35和 5 0 0μg pc DNA 3.1- p40的混和质粒 DNA ;C组 (对照组 )每头猪肌肉注射 5 0 0μg pc DNA3.1质粒DNA。共免疫 3次 ,每次间隔 3周。末次免疫后 30 d,每猪经背部皮肤攻击感染日本血吸虫尾蚴 6 0 0条。攻击后 45 d剖杀 ,经胸主动脉灌冲 ,并从门静脉收集计算成虫。从肝脏的同一部位切下小块肝组织 ,置 5 % KOH内消化后 ,计算每克肝组织虫卵数 (EPG)。比较各组间减虫率、减雌率和减卵率。在免疫前 ,末次免疫后和攻击后从猪耳静脉采血 ,分离血清 ,用 EL ISA检测抗 Sj C2 3抗体。结果 Sj C2 3组与 Sj C2 3+IL - 12组与质粒对照组相比 ,分别获得 2 9.2 %和 5 8.6 %的减虫率、5 0 .8%和5 8.8%的减雌率以及 48.2 %和 5 6 .4%

日本血吸虫中国大陆株23 kDa膜蛋白DNA疫苗诱导小鼠保护性免疫的研究

目的 研究日本血吸虫中国大陆株 2 3kDa膜蛋白 (SjC2 3)DNA疫苗诱导C5 7BL/6小鼠免疫保护作用。方法 将全长的SjC2 3基因克隆到真核表达载体pcDNA3.1,构建DNA疫苗 pcDNA3.1 SjC2 3。制备SjC2 3及IL 12的两个亚单位 p35、p4 0的DNA疫苗和对照 pcDNA3.1。 4 8只C5 7BL/6小鼠随机分为A、B、C 3组。A组小鼠肌注 10 0 μgpcDNA3.1;B组注射 10 0 μg pcDNA3.1 SjC2 3;C组肌注 pcDNA3.1 SjC2 3、pcDNA3.1 p35及pcDNA3.1 p4 0各 10 0 μg的混合物。每隔 2周各免疫 1次 ,共 3次。第 8周每鼠感染 4 5± 2条 /只尾蚴 ,4 5d后剖杀 ,计数成虫及肝内虫卵。采用免疫组化法检测SjC2 3及 p35、p4 0在小鼠局部组织内的表达 ;用脾细胞培养法检测经rSjC2 3 HD刺激后 ,攻击前、后小鼠脾细胞IL 2、IL 4、IL 10和IFN γ的水平。用Westernblotting检测血清中抗SjC2 3抗体。结果 SjC2 3以及p35、p4 0在免疫小鼠股四头肌细胞膜和细胞浆均获得表达。IL 2和IFN γ的水平攻击前、后在B组和C组均明显升高。Westernblotting检测抗SjC2 3抗体结果表明 ,免疫后两周 ,B组 8/10份血清为阳性 ,C组 9/10份血清阳性。B组和C组分别获得 2 6 .9%和 35 .4 %的减虫率 ,C组显著高于B组 (P <0 .0 5 ) ;减卵率分别为 2 2 .2 %和 2 8.4 %。

日本血吸虫23kDa膜蛋白DNA疫苗保护性免疫及IL-12免疫佐剂作用的研究

目的 研究日本血吸虫中国大陆株 2 3k Da膜蛋白 (Sj C2 3) DNA疫苗诱导 BAL B/ c小鼠免疫保护作用以及 IL- 12的免疫增强效果。方法 5 6只 BAL B/ c雌性小鼠随机分为 A、B、C、D4组 ,每组 14只。 A组 (对照组 ) ,于每鼠两腿股四头肌注射 10 0 μg pc DNA3.1质粒 DNA;B组 (Sj C2 3组 ) ,注射 10 0μg pc DNA 3.1- Sj C 2 3质粒 DNA;C组 (Sj C 2 3+IL - 12 DNA组 ) ,注射 10 0μg pc D-NA3.1- Sj C 2 3、10 0μg pc DNA 3.1- p35、10 0μg pc DNA3.1- p40质粒 DNA的混合液 ;D组 (Sj C2 3+r IL- 12蛋白组 ) ,免疫剂量同 Sj C2 3组。共免疫 3次 ,每次免疫间隔 2周 ,剂量和方法同第 1次。于末次免疫后 1个月 ,每鼠攻击感染 (4 5± 2 )条日本血吸虫中国大陆株尾蚴。但 D组的小鼠在攻击感染当天 ,及感染后第 2、4、6天经腹腔注射 0 .2 μg/鼠 r IL- 12蛋白。攻击后 45 d剖杀小鼠 ,计数成虫及肝内虫卵数。于末次免疫后 2周对照组及 Sj C2 3组用 51 Cr释放法测定 Sj C 2 3介导的特异性细胞毒作用 ;用脾细胞培养法检测经重组日本血吸虫 2 3k Da膜蛋白亲水区大片段融合蛋白 (GST- HD)刺激后 ,在免疫后及攻击后小鼠脾细胞 IL - 2、IL - 4、IL - 10和 IFN -γ的水平。分别于攻击前后 2周经小鼠尾静脉采血 ,用 EL

日本血吸虫22.6kDa有效抗原表位对小鼠免疫保护性的研究

目的 研究日本血吸虫 (中国大陆株 ) 2 2 .6 k Da有效抗原表位对小鼠的免疫保护性 ,预测其在抗血吸虫感染中的作用。方法 用纯化的抗 Sj2 2 .6 k Da的多克隆抗体 Ig G对噬菌体 12肽库进行 5轮免疫学筛选 ,挑取克隆 ,经 Western- blot免疫识别、动物初筛及序列分析后 ,将获得的阳性克隆免疫 BABL/ c小鼠。结果 共获得 4个有效抗原表位 ,各免疫组和对照组相比 ,4种表位混合免疫组小鼠 ,获得了 39.5 % (P<0 .0 5 )的减虫率及 5 7.1% (P<0 .0 1)肝总减卵率 ;4种表位分别免疫4组小鼠 ,各组分别获得了 2 7.5 % (P<0 .0 5 )、5 .4% (P<0 .0 5 )、2 2 .8% (P<0 .0 5 )、11.6 % (P<0 .0 5 )的减虫率及 41.4% (P<0 .0 1)、2 9.7% (P<0 .0 5 )、32 .2 % (P<0 .0 5 )、30 .9% (P<0 .0 5 )肝总减卵率。结论 所获得 4种有效抗原表位均可诱导宿主抗血吸虫感染的部分保护力 。

日本血吸虫22.6kDa重组蛋白对小鼠的免疫保护性研究

目的:研究日本血吸虫(中国大陆株)22.6 kDa 抗原作为血吸虫病疫苗候选分子的潜能,并探讨Sj22.6/Sj26 GST 融合蛋白作为复合疫苗的可能性。方法:用亲和层析法制备Sj22.6/Sj26 GST融合蛋白。将这两种蛋白分别免疫BALB/c小鼠后进行攻击感染试验。结果:Sj22.6 重组蛋白和Sj22.6/Sj26 GST 融合蛋白分别可诱导小鼠产生32.1% (P< 0.005) 和34.9% (P< 0.02)的成虫减虫率, 28.4% (P< 0.02)和45.1% (P< 0.005)的总减卵率。结论:rSj22.6 与Sj22.6/Sj26

日本血吸虫31／32kDa抗原纯化及诊断应用的研究(英文)

采用超凝胶柱层析结合超滤、透析、沉淀等方法分离纯化了日本血吸虫成虫３１／３２ｋＤａ抗原。经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、银染和免疫印迹分析，证明免疫及生化纯度。银染及ＰＡＳ证实此抗原是一种不含糖的多肽类组分。用于ＥＬＩＳＡ和ＩＨＡ诊断日本血吸虫病，与ＳＥＡ同样敏感，而特异性明显较优。

日本血吸虫22.6kDa抗原T细胞表位的重组、表达及初步鉴定

目的 鉴定日本血吸虫中国大陆株 2 2 .6kDa抗原 (Sj2 2 .6 )的T细胞表位。 方法 用计算机软件预测Sj2 2 .6分子的T细胞表位 ,设计并合成其编码核苷酸 ,定向克隆入融合表达载体pET 32c( + ) ,转化大肠杆菌BL2 1感受态细胞 ,经酶切及测序鉴定出重组克隆。阳性克隆经IPTG诱导表达 ,表达产物用NTA柱纯化。用纯化后的表位肽融合蛋白体外刺激C3H小鼠脾单个核细胞 ,3 H TdR掺入法检测其增殖。 结果 用计算机软件预测获得Sj2 2 .6抗原的 4个候选表位肽 ,并成功克隆入pET 32c( + )。其重组体均可表达分子量约 2 0kDa的融合蛋白 ,用NTA柱纯化后经 1 2 %聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS PAGE)显示单一条带。其中P4、P5、P6融合蛋白能有效刺激小鼠脾单个核细胞增殖。 结论 从Sj2 2 .6抗原中初步鉴定出P4、P5、P6

旋毛虫编码新生幼虫p46 kDa抗原基因重组融合蛋白对小鼠的免疫保护性研究

目的 探讨旋毛虫编码新生幼虫p4 6kDa抗原基因重组融合蛋白WN10对小鼠的免疫保护性。 方法 将纯化的重组融合蛋白WN10以 2 0 μg/只的剂量分 3次免疫小鼠后 ,攻击感染旋毛虫肌幼虫 2 0 0条 /只 ,检查旋毛虫 7日龄成虫数、雌虫体外产生新生幼虫数、感染 35d的肌幼虫数并计算减虫率 ,同时用ELISA法检测血清中抗WN10抗体IgG滴度。结果 WN10免疫小鼠后获得旋毛虫 7日龄成虫、肌幼虫的减虫率分别为 6 4 .2 8%和 6 1.2 1% ,均与感染对照组和佐剂对照组差异显著 ;获得雌虫产新生幼虫的减虫率为 16 .4 6 % ,与感染对照组和佐剂对照组差异不显著 ;WN10免疫组小鼠在第 3次免疫后 1周可检测到高滴度的抗WN10抗体IgG ,在攻击感染旋毛虫 9周后仍维持在较高水平。 结论 编码旋毛虫新生幼虫 p4

18kDa抗原诊断泡型包虫病的评价

目的：评价１８ｋＤａ抗原在泡型包虫病（ＡＥ）诊断中的价值。方法：用免疫印渍法检测３３例泡型包虫病、６９例囊型包虫病（ＣＥ）、３０例囊虫病和８２例健康人血清对泡型棘球蚴（Ｅｍ）和囊型棘球蚴（Ｅｇ）原头节１８ｋＤａ抗原的抗体反应。同时用羊包囊液抗原常规ＥＬＩＳＡ法检测上述血清。结果：ＥＬＩＳＡ试验，ＡＥ血清阳性率为９３．９％、ＣＥ为８５．５％、囊虫病为５０％、健康人为６．１％。显示３种患者血清存在较强的交叉反应。免疫印渍试验，两种原头节的１８ｋＤａ抗原对ＡＥ血清阳性反应均为９０．９％、ＣＥ分别为１０．１％和１３％、囊虫病患者为１３．３％和１６．７％。与健康人血清不发生反应。结论：１８ｋＤａ抗原可以有效的鉴别两型包虫病。

日本血吸虫可溶性虫卵抗原38kDa分子Dipstick快速诊断模式的初步建立

目的 建立简便的血吸虫病Ｄｉｐｓｔｉｃｋ快速诊断比方法 以纯化的日本血吸虫虫卵可溶性抗原（ＳＥＡ）３８ｋＤａ分子为诊断抗原，以胶体金标记的鼠抗人ＩｇＧ为二抗，建立 Ｄｉｐｓｔｉｃｋ快速诊断体系；检测日本血吸虫病人血清，急性期３７例、慢性期３０例，正常人５２例，肝吸虫病人血清３０例。结果 所测得的阳性率分别为９４．６％、８６．７％、１．９％、０％．伯论 以 ＥＡ ３８ｋＤａ纯化分子建立的血吸虫病Ｄｉｐｓｔｉｃｋ快速诊断法具有较好的敏感性和特异性，且简便快捷。

日本血吸虫未成熟虫卵26-28kDa抗原的分离与纯化

本文采用超凝胶AcA柱层析方法和SDS-PAGE结合凝胶洗脱方法等,分离纯化了日本血吸虫未成熟虫卵可溶性抗原(SIEA)26-28kDa组分.SDS-PAGE、免疫印迹分析(EITB)和银染色等证明,采用该方法分离纯化的26-28kDa抗原纯度高,有较强的免疫活性,并证明该抗原组分在SIEA中含量丰富.纯化的SIEA26-28kDa可作为抗日本血吸虫生殖产卵和抗卵胚发育侯选抗原,用于抗病保护性免疫的研究.

日本血吸虫31/32kDa重组抗原对小鼠免疫保护性研究

目的 探讨日本血吸虫 31/ 32kDa重组抗原 (rSj31/ 32 )抗血吸虫感染的免疫效果。方法 日本血吸虫 31/32kDa单克隆抗体免疫筛选的阳性克隆 312经IPTG诱导表达 ,表达产物rSj31/ 32加福氏佐剂免疫小鼠后进行攻击感染实验。结果 与对照组相比较 ,rSj31/ 32可诱导小鼠产生 30 1%的减虫率 ,6 3 2 %的减卵率 (P <0 0 1) ,虫卵肉芽肿平均面积和周长均明显降低 ,rSj31/ 32免疫能诱导一定水平的抗血吸虫抗体。 结论 结果表明 ,rSj31/ 32可诱导小鼠产生一定程度的保护免疫力 ,有可能作为血吸虫疫苗候选抗原分子。

合肥首例恙虫病病人血中东方体56kDa外膜蛋白部分基因的扩增及进化分析

采用恙虫病胶体金快速诊断试剂对安徽省合肥市一例不明原因发热病人血清进行检测，从该病人血块中提取DNA为模板，用恙虫病东方体特异性引物，PCR扩增出56kDa外膜蛋白部分基因，将扩增目的片段克隆至T载体进行测序并进行基因进化分析。结果显示，该病人血清中抗恙虫病东方体总抗体、抗东方体IgG及抗东方体IgM阳性；患者给予强力霉素治疗后迅速退热。采用PCR从病人血标本中扩增出1320bp东方体56kDa外膜蛋白基因片段，将基因片段测序结果在NCBI上做BLAST比对，显示该基因序列与昆明株和内蒙古株同源基因序列完全一致；进化树分析显示该序列与标准株Kuroki位于同一个分支。研究确认该发热病例为合肥市报告的首例恙虫病，其感染的恙虫病东方体为Kuroki型，推测合肥市可能为恙虫病新疫区。

用噬菌体随机肽库鉴定日本血吸虫22.6kDa抗原分子的表位

目的 筛选和鉴定日本血吸虫 (中国大陆株 ) 2 2 .6kDa抗原 (Sj2 2 .6)的表位。 方法 用纯化的抗Sj2 2 .6的多克隆抗体IgG对噬菌体十二肽库进行 5轮免疫学筛选 ,挑取克隆 ;采用Westernblotting免疫识别 ,将获得的阳性克隆免疫小鼠 ,并采用dot ELISA筛选能刺激小鼠产生较高滴度抗Sj2 2 .6抗体的阳性克隆 ;测定核苷酸序列 ,分析其表位与Sj2 2 .6抗原的同源性。 结果 经 5轮免疫学筛选后挑取的 1 4个克隆 ,用Westernblotting方法均能被抗Sj2 2 .6抗体识别。经动物免疫初步实验筛选 ,共获得 6个免疫原性较强的阳性克隆 ,测序结果获得 4种不同表位 ,其中 1种表位与Sj2 2 .6抗原具有较高的同源性 ,其余 3种表位与其无一级结构的同源性。 结论 获得的 4种日本血吸虫中国大陆株抗原表位 ,1种可能为结构表位 。

幽门螺杆菌27 kDa外膜蛋白的基因克隆和特性鉴定

背景:幽门螺杆菌（H.Pylori）是全球人群中感染范围最广的致病菌,现己被公认为慢性胃炎和消化性溃疡的重要致病因子,并与胃腺癌和胃淋巴瘤的形成密切相关。而H.Pylori疫苗可能成为控制这一全球范围感染的有效措施,其研制和开发已成为目前研究的热点。目的:探索研制H.Pylori疫苗的新途径,对H.Pylori27kDa外膜蛋白（OMP27）进行基因克隆和特性鉴定。方法:培养和收集H.Pylori菌株NCTC11637,采用酚:氯仿抽提和纯化基因组DNA。分别设计引物P1和P2,并以该基因组DNA为模板,以聚合酶链反应（PCR）方法扩增OMP27基因片段。构建pQE30-OMP27重组表达载体时,pQE30质粒载体和纯化的PCR产物均用限制性内切酶Kpnl和HindⅢ双酶切,再用T4 DNA连接酶将双酶切后的目的基因片段OMP27重组于pQE30的相应酶切位点之间,连接产物转化大肠杆菌XL1-Blue。挑选转化克隆、提取质粒,并进行Kpnl和HindⅢ双酶切和PCR方法鉴定,1％琼脂糖凝胶电泳观察酶切和PCR扩增结果,经测序分析确认后,筛选出插入目的基因的阳性克隆,命名为pQE30-OMP27。挑取单个含重组质粒PQE30-OMP27的工程菌（XL1-Blue）阳性克隆,进行培养和IPTG诱导表达后,经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）和Western blot进行蛋白表达和抗原性鉴定。

花生种子贮藏蛋白的氨基酸组成分析及发育过程中17.5 kDa多肽的合成规律

分析了两种不同蛋白质组成类型花生的子叶总蛋白３个主要组分及高甲硫氨酸类型花生的６０．５、４１、３８．５、１８和１７．５ ｋＤａ多肽的氨基酸组成，结果表明它们均含有 １７种氨基酸，其中天冬氨酸、谷氨酸和精氨酸含量最高，而甲硫氨酸含量和半胱氨酸水平都极低。高甲硫氨酸类型品种的各组分的甲硫氨酸含量均显著高于低甲硫氨酸类型品种的对应组分的甲硫氨酸含量，在这两种类型花生中伴花生球蛋白ＩＩ都是甲硫氨酸含量最高的组分。探讨了１７．５ ｋＤａ高甲硫氨酸多肽在花生种子发育过程中的合成规律。