水牛KDM1A/LSD1基因的克隆分析及真核表达载体的构建

本研究旨在对水牛组蛋白去甲基化酶KDM1A基因进行克隆,分析并构建真核表达载体,为研究其在水牛体细胞克隆胚胎中的作用提供基础。首先提取水牛卵巢总RNA,利用RT-PCR技术克隆得到水牛KDM1A基因并对其进行生物信息学分析。结果表明:水牛KDM1A基因编码区全长2 625 bp,预测编码874个氨基酸;水牛KDM1A与其他物种同源性较高且与生物分类学保持一致;其所编码蛋白分子式为C2375H3855N805O776S24,理论分子质量为56 872.11;其二级结构由19个α螺旋,47个β折叠,25个T转角和无规则卷曲组成;其高级结构在水牛、黄牛、人之间具有较高的相似性;本实验构建了水牛pcDNA3.1(+)-KDM1A真核表达载体,转染pcDNA3.1(+)-KDM1A可以显著提高水牛耳部成纤维细胞(BFFs)中KDM1A的表达水平;还发现卵母细胞中KDM1A的表达水平显著高于BFFs。

COX2抑制剂联合KDM1A基因对肺癌A549细胞凋亡的诱导作用研究

目的探讨COX2抑制剂塞来昔布或KDM1A siRNA对肺癌A549细胞增殖凋亡的影响及其机制。方法以LipofectamineTM 2000为载体,将合成的KDM1A siRNA转染人肺腺癌A549细胞,Western blot检测转染后A549细胞中KDM1A的表达。塞来昔布或si-KDM1A处理A549细胞,分为NC组、塞来昔布组、si-KDM1A组、塞来昔布+si-KDM1A组。CCK8法检测细胞活力,流式细胞术检测细胞凋亡率;H2DCFHDA荧光探针检测ROS含量;Western blot检测STAT3、磷酸化STAT3及下游与增殖凋亡相关的基因PCNA和Bax蛋白表达。结果转染si-KDM1A后,A549细胞KDM1A表达明显受到抑制,与空白对照组比较,差异具有统计学意义(P<0.05)。塞来昔布和si-KDM1A均能明显抑制A549细胞活力,诱导细胞凋亡,提高细胞内ROS含量,下调p-STAT3和PCNA表达,上调Bax表达,与NC组比较,差异均具有统计学意义(P<0.05);且二者联合对细胞增殖、凋亡及STAT3信号通路的影响更明显,细胞活力、凋亡率、ROS含量及p-STAT3、PCNA、Bax表达水平与塞来昔布组和si-KDM1A组比较,差异均具有统计学意义(P<0.05)。结论 COX2抑制剂或KDM1A siRNA均可抑制肺癌A549细胞活力,诱导细胞凋亡,二者联用强于单独使用,其机制可能与提高细胞内ROS含量及抑制STAT3信号通路有关。