抗KDRscFv复制缺陷型腺病毒载体的构建及鉴定

目的构建抗KDRscFv复制缺陷型腺病毒载体,为抗KDRscFv抗肿瘤血管生成的体内应用打下实验基础。方法采用重叠延伸PCR方法构建IL-2信号肽及抗KDRscFv融合基因,克隆于腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV,转染含pAdEasy-1的BJ5183细菌,经细菌内同源重组产生携带抗KDRscFv基因(含信号肽)的重组腺病毒载体pAd-抗KDRscFv,经脂质体法转染293细胞,包装产生携带抗KDRscFv基因的重组腺病毒Ad-抗KDRscFv。结果构建了表达抗KDRscFv基因的复制缺陷型腺病毒,且该重组腺病毒能在肝癌细胞株HepG2中高效表达。结论成功构建表达抗KDRscFv基因的复制缺陷型腺病毒载体,为进一步研究抗KDR-scFv在肿瘤治疗中的作用研究提供实验基础。

VEGF受体单抗与Luffin双靶融合毒素的构建及其对非小细胞肺癌细胞的抑制作用

目的构建含血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)受体单链抗体(KDRscFv)、尿激酶纤溶酶原激活剂(urokinase plasminogen activator,uPA)裂解位点(uPAcs)、丝瓜毒素(luffin-β)与KDEL(Lys-Asp-Glu-Leu)内质网驻留信号序列的双靶向融合毒素,并探讨其对非小细胞肺癌(non-small-cell lung carcinoma,NSCLC)细胞的抑制作用。方法全基因合成KDRscFv基因,RT-PCR法克隆luffin-β,重叠PCR法将两基因融合,其连接部位与C端分别引入uPA裂解位点uPAcs与KDEL,形成融合基因KDRscFv-uPAcs-Luffin-β-KDEL。将该融合基因克隆至原核表达载体pET-32a(+)中,转入大肠杆菌后,诱导其表达融合毒素蛋白Trx-EK-KDRscFv-uPAcs-Luffin-β-KDEL(TEKPLK)并纯化TEKPLK。用肠激酶(enterokinase,EK)切割TEKPLK后,纯化与回收靶向融合毒素KDRscFv-uPAcs-Luffin-β-KDEL(KPLK)。采用CCK-8(cell counting kit-8)、RT-PCR、Western blot等方法,体外检测靶向融合毒素KPLK经uPA酶裂解后释放Luffin-β对NSCLC细胞的抑制作用。结果成功诱导重组载体pET-32a(+)/KDRscFv-uPAcs-Luffin-β-KDEL表达相对分子质量约7.5×104含载体表达标签(Trx)的融合毒素蛋白TEKPLK,EK酶切该蛋白获得相对分子质量约5.8×104的靶向融合免疫毒素KPLK。CCK-8法检测表明,KPLK毒素的杀瘤活性成剂量-效应关系,其IC50约为35 ng/mL;RT-PCR和Western blot检测结果显示,KPLK经uPA酶体外裂解后能释放细胞毒素小分子Luffin-β,上调瘤细胞促凋亡基因caspase-3及其蛋白的表达。结论成功构建了KDRscFv-uPAcs-Luffin-β-KDEL融合基因及其原核表达载体,并获得相对分子质量约5.8×104的靶向融合毒素KPLK,该毒素经uPA酶体外裂解后能释放具杀瘤活性的Luffin-β毒素小分子。