利用酵母双杂交系统筛选与辣椒轻斑驳病毒126 kDa蛋白互作的辣椒寄主因子

【目的】辣椒轻斑驳病毒(pepper mild mottle virus,PMMoV)是世界范围内危害辣椒的主要病毒之一。126 kDa蛋白是PMMoV编码的重要致病因子,但致病机制目前仍不清楚。本研究旨在筛选与126 kDa蛋白互作的辣椒寄主因子,为解析PMMoV的致病机制提供理论依据。【方法】首先,通过同源重组法构建诱饵载体pGBK-126 kDa;并以辣椒叶片为试验材料,利用Trizol法提取辣椒叶片总RNA,制备辣椒酵母cDNA文库;之后,使用pGBK-126 kDa对cDNA文库进行筛选,并通过NCBI和Uniprot等对筛选结果进行序列比对和生物信息学功能分析,根据比对分析结果,选取可能参与到植物抗病通路的寄主因子,克隆其全长CDS构建到pGADT7载体,酵母双杂交(Y2H)、双分子荧光互补(BiFC)和荧光素酶互补(LCI)进一步验证126 kDa与寄主因子之间的互作;最后,通过瞬时过表达寄主蛋白分析其在PMMoV侵染过程中的作用。【结果】提取获得高质量辣椒RNA,无降解;获得高质量酵母cDNA文库,成功构建诱饵质粒pGBK-126 kDa,筛选得到与126 kDa蛋白互作的辣椒寄主因子18个;生物信息学分析结果显示,18个寄主因子广泛参与到植物酶系统、物质及能量代谢调节过程、DNA结合转录过程、激素合成过程以及防御响应等多个通路;选取的其中3个寄主因子(LA2、PDHE1、BXL1)在一对一酵母双杂交互作验证中均存在与126 kDa的相互作用,表明初筛的结果可靠;通过BiFC和LCI进一步验证了126 kDa与BXL1之间体内外互作;瞬时过表达BXL1发现PMMoV的侵染受到了显著抑制。【结论】成功构建了pGBK-126 kDa诱饵质粒,基于该质粒对酵母cDNA文库进行筛选得到18个互作的寄主因子,广泛涉及植物生命活动过程中的多个通路,筛选结果验证可靠,其中,BXL1存在与126 kDa的体内外相互作用,并能够抑制PMMoV的侵染。研究结果可为深入探究PMMoV的侵染机制提供良好的理论和材料基础。

恙虫病东方体Gilliam株56kDa蛋白部分基因的原核表达及初步鉴定

目的 对恙虫病东方体Gilliam株 5 6kDa蛋白部分基因进行原核表达 ,以获得高效表达、有生物活性目的蛋白 ,为恙虫病诊断试剂的研制打下基础。方法 根据Gilliam株东方体 5 6kDa蛋白基因序列设计特定引物 ,用PCR法扩增出编码5 6kDa抗原富含亲水区及同源性高的C端一段长约 70 0bp的DNA ,插入原核载体PGEX - 4T - 2 ,转化大肠杆菌TGI ,抽提质粒 ,酶切鉴定 ,含插入片段的重组质粒进行序列分析 ,再转化表达宿主菌大肠杆菌BL2 1(DE3) ,IPTG诱导表达 ,用SDS -PAGE及Western -blot进行分析鉴定。结果 SDS -PAGE检测表明该截短片段以融合蛋白的方式得到成功表达 ,在相对分子量 5 8kDa处有表达条带 ,经薄层扫描分析 ,目的蛋白条带占全菌蛋白的 30 5 %。Western -blot证实该融合蛋白能被恙虫病患者阳性血清识别。结论 表达产物初步鉴定具有生物活性 。

猪链球菌2型溶血素基因与38KDa蛋白基因克隆及联合表达

目的:研究有效的猪链球菌病疫苗。方法:以四川株猪链球菌2型基因组DNA为模板分别扩增溶血素基因和38KDa基因主要功能区基因;并经连接、克隆及酶切鉴定。分别构建原核表达载体pET32a-Sly、pET32a-38KDa,提取阳性克隆质粒分别进行双酶切并纯化,通过PCR串联两片断,将目的片断定向克隆到表达载体pET32a中,经测序正确后,重组质粒转化入大肠杆菌BL21 (DE3),用IPTG进行诱导表达。结果:重组菌菌体裂解物经SDS-PAGE电泳可检测到相对分子量约为60Ku的重组蛋白,表达产物经纯化后,免疫印迹法(Western-blotting)证实该重组蛋白可以与SS2阳性血清发生特异性反应。结论:本研究为重组蛋白的免疫保护应用奠定基础。

日本血吸虫32kDa蛋白质基因在真核表达载体中的亚克隆

设计和合成特定寡核苷酸引物 ,TRIZOL提取日本血吸虫成虫RNA ,RT—PCR法扩增日本血吸虫 32kDa蛋白质 (Sj32 )基因编码序列 ,将扩增产物连接pGEM—T克隆载体 ,再亚克隆到真核表达载体 pBKCMV中。结果 :RT—PCR法特异性扩增出Sj32编码基因片段 ,其大小约为1 2 70bp ,经双酶切、PCR鉴定表明所构建的质粒pGEM—Sj32和pBK—Sj32中含有目的基因。pBK—Sj32重组质粒的成功构建 ,为进一步表达Sj32及其在血吸虫病免疫诊断、免疫预防中的作用研究提供了条件。

苏云金芽胞杆菌以色列亚种20kDa蛋白质对CytA蛋白溶细胞作用的影响

为了证明苏云金芽胞杆菌以色列亚种２０ｋＤｅ蛋白质对ＣｙｔＡ蛋白溶细胞作用的影响， 根据２０ｋＤｅ蛋白质和ｃｙｔＡ蛋白基因的核苷酸序列，用ＡＭＰＬＩＦＹ程序设计了一套带有酶切位 点的引物，经ＰＣＲ扩增分别获得了２０ｋＤｅ蛋白质和ｃｙｔＡ蛋白基因。将其基因与表达载体 ｐＵＨＥ２４连接并转化到大肠杆菌ＸＬＩ和ＤＨＳ 分别获得含２０ｋＤａ蛋白质基因的克隆子 ＬＺ２９；含ｃｙｔＡ基因的克隆子ＬＺｃｙｔＡ和含有二者基因的重组子ＬＺ２０Ａ．在ＩＰＴＧ诱导下，测定 了不同克隆株基因表达产物对大肠杆菌细胞生长的影响。结果表明：ＬＺ２０的细胞生长不受影 响；ＬＺｃｙｔＡ的细胞被杀死；ＬＺ２０Ａ的细胞生长也不受影响。这表明２０ｋＤａ蛋白质基因与ｃｙｔＡ 蛋白基因重组后，２０ｋＤａ蛋白质基因表达产物可保护ＣｙｔＡ蛋白对大肠杆菌的溶细胞作用，而 巳这种作用并不因不同大肠杆菌受体而改变。

重组结核分枝杆菌38KDa蛋白用于军人结核分枝杆菌感染筛查

目的评价重组结核分枝杆菌蛋白38KDa皮试注射液（rTPA38）用于军人结核分枝杆菌感染筛查的价值。方法以结核菌素纯蛋白衍生物（PPD）为对照，采用同体双臂Mantoux法（皮内注射）为1150人同时做PPD和rTPA38皮试；皮试后24h，48h双盲测量皮试反应（包括红晕或硬结）。PPD和rTPA38皮试阴性者接种卡介苗，3个月后同前进行皮试试验。结果局部皮肤红晕（或硬结）横、纵平均直径≥5mm为阳性。24．6％受试者rTPA38皮试反应阳性，阳性反应直径集中于5mm～10mm；53．0％受试者PPD皮试反应阳性，阳性反应直径集中于5mm～15mm。rTPA38皮试反应阳性率随年龄增长基本呈现上升趋势，同一年龄段，rTPA38皮试反应阳性率明显低于PPD（P〈0．01）。有卡痕与无卡痕受试者rTPA38皮试反应阳性率比较、统计学分析差异有极显著性意义（χ^2=27．06，P〈0．01）。PPD皮试阳转率与rT—PA38皮试阳转率分别为62．0％和27．2％，两者比较差异有极显著性意义（χ^2=52．90，P〈0．01）。结论rTPA38可作为结核分枝杆菌感染筛查的诊断试剂。

结核分支杆菌14KDa蛋白的基因克隆、表达、纯化及其抗原性的研究

目的基因克隆、表达、纯化结核分枝杆菌14KDa蛋白,研究其抗原性,评价其在血清学诊断中的价值。方法以结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA为模板,应用PCR技术扩增14KDa蛋白基因片断,将其插入到高效表达载体PET-22b(+)上,构建重组质粒PET-22b(+)/14KDa,重组质粒在大肠杆菌中由IPTG诱导表达,表达产物经金属离子鳌合亲和层析方法纯化,免疫印迹和酶联免疫吸附(ELISA)试验分析重组蛋白的抗原性。结果构建了具有正确基因序列的14KDa蛋白重组质粒,在大肠杆菌BL21(DE3)中以可溶性蛋白形式表达,重组蛋白的表达量占菌体蛋白的40.8%,经过一步金属离子鳌合亲和层析后得到纯度为94.3%的目的蛋白。免疫印迹试验结果表明该蛋白能与羊抗结核血清发生特异免疫结合反应。应用ELISA方法对结核血清参考品进行检测,敏感性和特异性分别为75.6%和96.0%。结论获得了能高效表达14KDa蛋白的大肠杆菌工程菌,目的蛋白以可溶性形式表达,该重组蛋白具有良好的免疫原性,可望成为结核血清学的诊断抗原之一。

恙虫病东方体Karp株47kDa蛋白成熟肽的克隆与表达

目的 :克隆表达恙虫病东方体 (Orientiatsutsugamushi,Ot)Karp株 4 7kDa表面蛋白的成熟肽 ,探索其作为疫苗及诊断抗原的可能性。方法 :采用PCR方法 ,从 OtKarp株菌种基因组DNA中扩增出 4 7kDa成熟蛋白基因片段 ,将该片段克隆于原核表达载体pQE30 ,构建成重组质粒pQE30 4 7,转化大肠杆菌 (E coli) ,经IPTG诱导表达 ,SDS_PAGE和Western_blotting检测目的蛋白的表达。结果 :①获得长约 12 72bp的OtKarp株 4 7kDa外膜蛋白基因 ;②SDS_PAGE和免疫印迹显示该重组质粒转化的E coli有一相对分子量约为 4 3× 10 4 的独特蛋白带 ;③重组表达质粒序列分析结果显示pQE30 4 7中插入的基因片段的序列与已报告的OtKarp株 4 7kDa外膜蛋白基因序列基本一致 ,并与已知序列相同。结论 :获得了OtKarp 4 7kDa蛋白基因 ,并在E coli中实现了表达 。

日本血吸虫31/32KDa蛋白质基因扩增及克隆

目的 克隆日本血吸虫 31/ 32 KDa蛋白质的编码基因 ,用于血吸虫病免疫诊断和预防。方法 以日本血吸虫成虫 RNA为模板逆转录合成 c DNA链 ,参照 S.m 31/ 32编码序列设计合成引物 ,用 PCR法扩增 31/ 32 KDa蛋白质基因编码序列 ,将其克隆入 p GEM- T载体 ,并用双酶切和以质粒为模板的 PCR进行鉴定。结果 RT- PCR扩增出一条约 12 70 bp大小的特异性条带 ,重组质粒的双酶切和以质粒为模板的 PCR均获得了一条与 RT- PCR扩增出的条带大小相同。结论 日本血吸虫 31/ 32 KDa蛋白质重组 p GEM- T克隆载体的成功构建 ,为进一步研究提供条件。

大鼠周围神经43kDa蛋白的生化初步分析

目的:提取大鼠损伤坐骨神经组织中表达增强的43kDa蛋白(PNP-43),并对PNP-43进行生化初步分析。方法:纯化抗PNP-43单克隆抗体,将纯化的抗PNP-43单克隆抗体与CNBr-activatedSepharose4B交联,用亲和层析的方法,提取PNP-43,并将提取的PNP-43进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和等电聚焦凝胶电泳(IEF)分析,考马斯亮蓝染色,取SDS-PAGE后染色的43kDa蛋白区带胶条,进行基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱检测(MALDI-TOF-MS),测定肽质量指纹图谱,在相应的蛋白质谱数据库(MS-Fit)中检索。结果:⑴、经层析系统紫外检测,亲和层析后洗脱,在280nm波长处显示一个的紫外吸收峰。⑵、亲和层析获得的蛋白,经SDS-PAGE分析,在43.0kDa标准蛋白位置出现单一蛋白条带。⑶、经IEF分析,PNP-43的等电点(pI)为5.8。⑷、经MALDI-TOF-MS检测,测定肽质量指纹图谱,通过MS-Fit检索未发现有与该蛋白完全相同的质谱数据。结论:用亲和层析的方法,获得了大鼠损伤坐骨神经组织中表达增强的PNP-43,通过质谱分析和MS-Fit检索提示未发现有与该蛋白完全相同的质谱数据。为进一步深入研究PNP-43的结构与功能提供了科学依据。

结核分枝杆菌早期分泌抗原靶6kDa蛋白原核载体的构建及在E.coli中的高效表达

目的获得高效表达的结核分枝杆菌早期分泌抗原靶6kDa蛋白(ESAT-6)。方法利用PCR方法扩增出ESAT-6基因片段,将酶切处理后的基因片段定向克隆到原核表达载体pET-21b(+),酶切分析和序列测定鉴定出ESAT-6基因的阳性重组子,将其转化入E.coliBL21(DE3),阳性菌株经IPTG诱导,SDS-PAGE和免疫印迹分析靶蛋白的表达;重组蛋白经Ni-NTAHis.BindResins纯化。结果成功扩增出ESAT-6基因片段,构建了重组表达质粒pET-ESAT-6,SDS-PAGE显示表达产物分子量约为6kD,经亲和纯化后的ESAT-6重组蛋白纯度高,且能被结核病人血清所识别。结论利用pET原核表达系统成功的对结核分枝杆菌ESAT-6重组蛋白进行高效表达和纯化,重组蛋白具有良好的免疫活性。

抗肺炎衣原体42kDa蛋白种特异性单抗的制备及应用

目的 制备肺炎衣原体 (Cpn) 4 2kDa蛋白单克隆抗体并了解其在Cpn感染诊断中的应用价值。方法 采用纯化的Cpn 42kDa蛋白带制备出 2株特异性抗Cpn 42kDa蛋白单克隆抗体 ,用其中一株建立了检测Cpn的直接免疫荧光法 (DFA)。结果 2株能稳定分泌抗Cpn单抗的杂交瘤细胞株Ad6、Db1 均为IgG1 ,染色体数目为 90～ 1 0 2条 ,效价分别为 1∶32 768、1∶1 6 384(微量免疫荧光法 ,Micro -IFA)。将腹水 1∶1 0 0稀释 ,该单抗只与Cpn呈现阳性反应 ,与其他衣原体和呼吸道病原菌均无交叉反应。Westernblot证实单抗结合Cpn蛋白的分子量为 42kDa,且不与其他衣原体反应。建立的DFA对 1 2 0名呼吸道感染者的咽拭子、肺泡灌洗液、痰检测 ,其结果和PCR试剂盒检测结果经统计学处理 ,二者相关系数为 0 .9667,符合临床检测要求。结论 DFA灵敏、准确 ,可用于Cpn的检测。

血吸虫成虫31/32kDa蛋白分子研究的进展

曼氏血吸虫成虫31/32kDa蛋白的基因已经克隆和表达,核苷酸和氨基酸序列分析表明:31kDa蛋白在多肽水平上与哺乳动物组织蛋白酶B有同源性,32kDa蛋白的核苷酸顺序与血红蛋白酶相同。来源于成虫肠道的血吸虫31/32kDa蛋白可用于三种人体血吸虫病时免疫诊断。

佐剂对日本血吸虫31/32kDa蛋白保护性免疫力的影响

本实验用纯化的日本血吸虫３１／３２ｋ Ｄａ 蛋白（ Ｓｊ３１／３２ 蛋白）辅以ｐｏｌｙａｌｐｈａｏｌｅｆｉｎ（ Ｐ Ａ Ｏ）佐剂免疫小鼠，同时比较了 Ｓｊ３１／３２ 蛋白辅以福氏完全佐剂（ Ｆ Ｃ Ａ）对小鼠保护性免疫力的影响。 Ｓｊ３１／３２ 蛋白＋ Ｐ Ａ Ｏ 组小鼠减虫率为３７５５％ ，肝减卵率为６７０２％ ； Ｓｊ３１／３２ 蛋白组小鼠减虫率为２１１８％ ， 肝减卵率为 ４９０３％ ； Ｓｊ３１／３２ 蛋白＋ Ｆ Ｃ Ａ 组小鼠减虫率为 ２４０２％ ， 肝减卵率为５２２４％ 。结果提示， Ｓｊ３１／３２ 蛋白辅以 Ｐ Ａ Ｏ 佐剂的减虫作用优于 Ｓｊ３１／３２ 辅以 Ｆ Ｃ Ａ 的减虫作用（ Ｐ＜ ００５），且明显强于单纯 Ｓｊ３１／３２ｋ Ｄａ 蛋白的保护性免疫作用（ Ｐ＜ ００１）。

重组结核分枝杆菌38kDa蛋白的表达、纯化和复性及免疫特性的研究

目的构建结核分枝杆菌38kDa的重组质粒,在大肠杆菌中表达、纯化和复性重组蛋白,并评价其在结核病血清学诊断方面的价值。方法用PCR方法从结核分枝杆菌H37Rv基因组中扩增出psts1基因片段,连接到表达载体PET30a中,在大肠杆菌中表达;应用组氨酸标签(His-Tag)纯化重组蛋白;在PBS中通过半透膜恢复重组蛋白的天然结构。结果构建了含38kDa重组质粒的大肠杆菌工程菌,并以包涵体形式表达重组蛋白38kDa,其占细胞总蛋白的55%;重组蛋白变性后经镍柱纯化,其纯度达90%以上;通过半透膜完全恢复重组蛋白的天然结构,经蛋白印迹证实重组蛋白能与结核杆菌多克隆抗体结合。结论具有天然结构和高纯度的重组融合蛋白有可能成为有效的结核病血清学诊断的候选抗原。

重组结核分枝杆菌11 kDa蛋白皮肤试验与结核菌素皮肤试验的比较研究

目的比较重组结核分枝杆菌11 kDa蛋白(重组11 kDa蛋白)皮肤试验与结核菌素皮肤试验(PPD)两种检测方法,探讨更适合结核分枝杆菌潜伏感染者的筛查方法。方法选取2015年9月北京市大兴区某大学新生共461名,进行重组11 kDa蛋白和PPD的同体双臂皮肤试验,分别于不同前臂皮内注射0.1 mL重组11 kDa蛋白(10μg/L)和0.1 mL结核菌素纯蛋白衍生物(TB-PPD)(50 U/mL),观察注射后72 h后皮肤反应。于皮肤试验前采集461名志愿者的静脉血,进行体外γ干扰素释放试验(T-SPOT.TB)检测,采用T-SPOT.TB试剂盒进行。比较重组11 kDa蛋白皮肤试验、结核菌素PPD皮肤试验的差异性。结果以注射72 h后的硬结反应进行统计,2种检测结果显示男女阳性率比较,差异无统计学意义。重组11 kDa蛋白皮肤试验中阳性反应者为17名,阳性率为3.68%;PPD皮肤试验中强阳性反应者为8名,强阳性率为1.74%。以T-SPOT检测结果为标准,重组11 kDa蛋白皮肤试验灵敏度、特异度、准确度分别为39.53%,100.00%,94.36%;PPD皮肤试验灵敏度、特异度、准确度分别为16.28%,99.76%,91.97%。结论重组11 kDa蛋白皮肤试验灵敏度高,与体外T-SPOT.TB检测结果一致且简便易行,有望成为结核分枝杆菌潜伏感染的新的筛查方法。

伪旋毛虫21kDa蛋白的分子克隆和特性

伪旋毛虫(Trichinella pseudospiralis)是广泛寄生于脊椎动物骨骼肌细胞的旋毛虫形线虫属的一种。幼虫寄生时无包囊形成,且病理损害涉及到肌细胞的全长。幼虫的排泄、分泌物(ES)是引起肌细胞变性的原因之一。目前对伪旋毛虫幼虫ES的抗原成份了解尚少,为此作者用ES免疫血清从伪旋毛虫幼虫cDNA文库中筛选出一重组蛋白,并对其免疫学特性进行了鉴定。

一种与恶性疟原虫MSP1复合体相关、由MSP6基因编码的36kDa蛋白

恶性疟原虫MSP-1,-2,-4,-5均以GPI锚定于裂殖子表面,而可溶性MSP-3部分地附着于裂殖子表面,MSP-1为200 kDa前体蛋白质,需经两次蛋白水解才产生以非共价形式多肽复合体结合于裂殖子表面,MSP1复合体还包括与MSP-1无关的由其它不同基因表达的22 kDa和36 kDa两条肽。