KGF-2单克隆抗体间接ELISA筛选方法的建立

目的建立KGF-2单克隆抗体间接ELISA的筛选方法 ,制备KGF-2单克隆抗体.方法以KGF-2为抗原免疫BALB/c小鼠,获得抗血清.通过棋盘滴定方法确定间接ELISA的抗原包被浓度及一抗、二抗最佳工作浓度;利用建立特异性好的间接ELISA方法筛选杂交瘤细胞株.结果通过棋盘滴定最终确定了500μg/L的抗原包被浓度、1∶1 000的一抗血清稀释倍数及1∶2 000的二抗血清稀释倍数;筛选到两株可稳定分泌抗体、效价较高的杂交瘤细胞株.结论该研究建立了灵敏度高、特异性好的间接ELISA筛选体系,可用于KGF-2单克隆抗体的制备及检测.

KGF-2治疗激光角膜灼伤的形态计量学研究

目的应用形态计量学方法观察角质细胞生长因子-2(keratinocyte growth factor-2,KGF-2)对激光角膜灼伤的治疗作用。方法用CO2激光造成角膜灼伤模型,通过对灼伤斑的图像分析和透光率测定,观察KGF-2的治疗作用。结果 KGF-2滴眼治疗可以缩小激光角膜灼伤斑的面积,促进角膜透明度的恢复。结论一定浓度的KGF-2对激光角膜灼伤具有明显的治疗作用。

祛异康对子宫内膜异位症模型大鼠COX-2及KGF表达的影响

目的观察祛异康对子宫内膜异位症大鼠异位内膜COX-2及KGF表达的影响,探讨祛异康治疗子宫内膜异位症的机制。方法采用手术移植法建立大鼠子宫内膜异位症模型,随机分为空白对照组、模型组、祛异康高、中、低剂量组、丹那唑组。造模成功各组给药4W,免疫组化方法检测大鼠在位、异位子宫内膜组织COX-2及KGF的表达。结果各组大鼠异位子宫内膜组织COX-2及KGF与空白对照组比较,表达明显上升(P<0.05);祛异康低、中、高剂量组、丹那唑组与模型组相比COX-2及KGF表达明显下降(P<0.05)。结论祛异康能明显抑制异位症模型大鼠异位内膜的生长,其治疗机理可能是通过降低COX-2及KGF在异位内膜组织中的表达而实现的。

重组KGF-2突变体对TNBS诱导的复发性大鼠炎性肠病模型治疗作用的研究

目的制备复发性大鼠炎性肠病模型,评价重组KGF-2突变体(STEA)给药对2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)诱导的复发性大鼠炎性肠病模型的治疗效果。方法利用2%的TNBS(100mg/kg)对雄性Wistar大鼠进行灌肠,3周后,再次利用TNBS(10毫克/只)处理这些大鼠。于再次灌肠当天,治疗组的大鼠腹腔注射3mg/kg STEA,模型对照组和正常组注射等量的PB缓冲液,每天1次,连续7天。对各组大鼠的生存状态、血清中IL-6和IL-1β的表达水平、以及结肠组织病理变化等情况进行观察和分析。结果利用TNBS二次致敏的方法,成功制备了复发性大鼠炎性肠病模型。STEA给药能显著降低模型大鼠血清中IL-6和IL-1β的表达水平,提高大鼠的存活率,促进受损结肠黏膜的修复。结论 STEA对TNBS诱导的复发性大鼠的结肠损伤具有治疗作用。

重组人KGF-2突变体对小鼠小肠辐射损伤的防治作用研究

目的探讨重组人KGF-2突变体给药对60Coγ全身照射小鼠小肠黏膜损伤的保护作用。方法将小鼠分为正常组、模型组、重组KGF-2突变体防治组和安多霖防治组。利用60Coγ射线放射源对模型组和防治组小鼠进行全身照射,总剂量为6.5Gy。从存活率、生存状态和小肠组织病理切片等方面分析重组人KGF-2突变体的防治效果。结果重组人KGF-2突变体防治组存活率明显高于安多霖防治组和模型组;病理切片观察结果显示,重组人KGF-2突变体给药能够促进小肠隐窝细胞的增生,加快受损肠黏膜上皮的修复。重组人KGF-2突变体防疗组在毛色、行动状态等形态学指标上也明显好于模型组。结论重组人KGF-2突变体给药可以显著提高存活率,对60Coγ照射小鼠的小肠组织损伤具有较好的防治作用。

KGF-2治疗角膜烧伤的角膜斑翳面积测定和透明度分析

目的应用形态计量学方法观察角质形成细胞生长因子-2(KGF-2)对角膜碱烧伤的治疗作用。方法 用NaOH溶液造成角膜碱烧伤模型,通过烧伤斑的图像分析和透光率OD值测定,观察KGF-2的治疗作用。结果KGF-2滴眼治疗有利于角膜碱烧伤斑面积的缩小和角膜透明度的恢复。结论一定浓度的KGF-2对角膜碱烧伤具有明显的治疗作用。

重组人角质细胞生长因子2对辽宁绒山羊血清KGF-2浓度的影响

研究旨在探讨不同处理方式给药后羊血清角质细胞生长因子2 (KGF-2)的浓度变化趋势,为重组人角质细胞生长因子2 (rhKGF-2)调控羊绒生长筛选合适的处理方法和剂量提供参考。试验选择24只5~7月龄、体重为(25.76±1.94) kg的辽宁绒山羊,公、母各半,随机分为4组,每组6个重复,每个重复1只羊。以皮下注射方式,试验1组注射rhKGF-2胶原蛋白溶液,试验2组注射rhKGF-2温敏感凝胶溶液,试验3组注射rhKGF-2生理盐水溶液,试验4组为对照组,不做rhKGF-2处理。共设3个试验周期,每个周期18 d;依次设置低、中、高(10、20、30μg/kg)等3个剂量,每个周期开始时一次性注射18 d用量;研究不同给药方式和剂量对注射后血清KGF-2浓度变化的影响,探讨适宜的给药方式和剂量。结果显示:以胶原蛋白溶液和温敏感凝胶溶液形式皮下注射rhKGF-2后,血清KGF-2浓度先增加后降低,呈近似抛物线形式变化;以生理盐水溶液形式给药后,血清KGF-2浓度迅速升高达到峰值后断崖式直线下降。随着处理剂量增加,3个试验组血清KGF-2浓度峰值出现的时间均向后延迟,KGF-2高浓度维持时间延长;在30μg/kg的剂量时,试验1组的上述两个时间参数为90和426 h,试验2组为138和426 h,试验3组为42和138 h。对于同一种处理方式,剂量增加可使血清KGF-2浓度绝对值增加。研究表明,通过外源供给方式给绒山羊补充KGF-2,增加供给剂量能够提高血清KGF-2绝对浓度、延迟峰值出现时间、延长高浓度维持时间;以胶原蛋白溶液和温敏感凝胶的方式补充KGF-2效果相近,但考虑到可操作性,以前者的效果更好。

角质细胞生长因子-2(KGF-2)研究进展

角质细胞生长因子-2(KGF-2)能够特异性促进上皮细胞的增殖、分化和迁移,增强细胞合成的能力,因而在治疗皮肤损伤及溃疡、美容等方面有多重应用,为当前国际细胞因子药物开发的热点。本文对KGF-2的分子结构和性质、生物学功能、受体、表达及纯化条件优化、稳定性等方面进行综述。

人角质化细胞生长因子-2基因的克隆、表达及产物的纯化、鉴定

用高表达菌株BL 2 1codonpluscompententcells表达重组人角质化细胞生长因子 (hKGF 2 )蛋白并初步纯化和检测其活性。通过RT PCR从流产胎儿肺组织中钓取hKGF 2cDNA ,将其克隆入pBV2 2 0载体质粒。在大肠杆菌BL 2 1codonpluscompentcells中表达hKGF 2蛋白。采用亲和层析和离子交换层析分离纯化 ,以细胞增殖实验测定表达蛋白的生物活性。结果显示 ,hKGF 2蛋白在BL2 1中得到高效表达 ;hKGF 2蛋白能刺激NIH3T3细胞的增殖 ,具有显著的促有丝分裂活性。

角质细胞生长因子-2与核糖体蛋白L22相互作用的发现及在哺乳动物细胞中的验证

通过聚合酶链式反应从人胎肝cDNA文库中钓取KGF 2cDNA ,构建诱饵蛋白载体 pAS2 1 KGF 2并对其自身转录激活活性进行鉴定 ,利用酵母双杂交系统筛选人胎肝cDNA文库 ,挑选双阳性克隆 .DNA序列分析和同源检索显示 ,所获侯选蛋白为人核糖体蛋白L2 2 (RPL2 2 ) .将KGF 2和侯选蛋白分别克隆至哺乳动物细胞双杂交的BD、AD质粒中 ,共同转染COS 7细胞 ,通过CAT分析验证了KGF 2和侯选蛋白之间的相互作用 .为阐明KGF 2作用的分子机制提供有益线索 .

角质细胞生长因子2对细胞生长、移行及创伤愈合的作用

角质细胞生长因子2(KGF-2)是成纤维细胞生长因子超家族的一员,由间质细胞合成并分泌,能特异促进上皮细胞增殖、分化与迁移,对脊椎动物多种组织和器官的发育起重要调控作用.通过PCR从人的肾组织cDNA文库中克隆分离获得了KGF-2的cDNA,表明该因子在成人肾中有表达.采用大肠杆菌表达并纯化重组蛋白用于生物学功能研究的结果显示:KGF-2在体外不仅能够促进角质细胞的生长和增殖,而且对其凋亡具有抑制作用,还对细胞的移行具有影响.在动物实验中,KGF-2能促进皮肤切除产生的伤口愈合,提示该蛋白质可以作为创伤治疗或辅助用药的候选分子.

人角质细胞生长因子2真核表达载体的构建及功能验证

目的:构建人角质细胞生长因子2(KGF-2)基因真核表达载体,探索KGF-2的上皮细胞迁移功能。方法:以人乳腺cDNA文库为模板,PCR扩增KGF-2基因片段,将其插入pXJ-40-myc,经双酶切和测序验证后,将重组质粒转染HEK-293T细胞,采用Western印迹检测重组蛋白;转染人肠上皮细胞FHC,采用细胞划痕实验检测细胞迁移能力。结果:PCR扩增获得627 bp的DNA产物,插入pXJ-40-myc载体,双酶切及测序结果证明重组质粒含有目的序列;转染HEK-293T细胞,Western印迹检测到相对分子质量约23×103的目的蛋白;细胞划痕实验显示,转染Myc-KGF-2的FHC细胞较未转染或转染空载体的细胞迁移能力强。结论:构建了人KGF-2基因真核表达载体,并验证了其促进细胞迁移的功能。

壳聚糖复合KGF-2突变体温敏敷料联合简易负压吸引法对压力性损伤的疗效

目的探究壳聚糖复合角质细胞生长因子(keratinocyte growth factor-2,KGF-2)突变体温敏敷料联合简易负压吸引法对长期卧床老年患者大面积压力性损伤的治疗效果。方法选择2016年1月至2018年12月我院普外科收治的90名大面积压力性损伤患者,随机分为对照组与观察组,各45例。对照组患者采用简易负压吸引联合传统泡沫敷料治疗,观察组患者在此基础上联合壳聚糖复合KGF-2突变体温敏敷料填充。比较两组患者的伤口愈合效果以及创面细菌检出率。结果观察组患者的伤口愈合总有效率(93.3%)明显高于对照组(75.6%),差异有统计学意义(χ^2=5.41,P=0.003)。观察组患者细菌检出率(8.89%)显著低于对照组(35.56%),差异有统计学意义(χ^2=3.02,P=0.003)。结论壳聚糖复合KGF-2突变体温敏敷料联合简易负压吸引法能显著促进长期卧床老年患者大面积压力性损伤创面愈合,降低交叉感染的风险,具有较好的临床应用效果。

穿膜肽KGF-2的构建及其对HaCaT增殖作用的影响

目的:构建穿膜肽KGF-2(TAT-KGF-2),研究其对人角质形成细胞HaCaT的增殖作用。方法:采用普通PCR技术和特殊引物从人胚胎肺成纤维细胞cDNA中扩增出目的基因TAT-KGF-2,并将其插入pET-28a(+)载体中构建pET28a-TAT-KGF-2重组质粒;将该质粒转化大肠杆菌Rosetta(DE3),IPTG诱导表达重组蛋白TAT-KGF-2;通过Ni-NTA柱纯化获得目标重组蛋白并利用Western blot进行鉴定;MTT法研究TAT-KGF-2对HaCa的增殖作用。结果:成功构建pET28a-TAT-KGF-2重组质粒,经序列比对,与GenBank上公布的人KGF-2基因序列同源性达到100%;获得穿膜肽KGF-2蛋白,分子量约为19 kDa,纯度达到95%以上;TAT-KGF-2对HaCaT在12.5ng/ml时具有增殖作用,并呈浓度依赖性,而且与不具有穿膜功能的KGF-2相比有更强的增殖效果。结论:成功纯化出TAT-KGF-2蛋白,并验证其对HaCaT具有增殖作用,为进一步研究该蛋白的结构和功能奠定了基础。

CO_2点阵激光及外用KGF-2凝胶对小鼠毛发周期性再生的疗效观察

目的观察CO_2点阵激光及外用KGF-2凝胶对小鼠毛发周期性生长的影响。方法将小鼠随机分为空白组、KGF-2组、激光组及激光联合KGF-2组,进行相对应的处理,并记录每组小鼠进入生长期的平均天数。结果点阵联合KGF-2组提前进入生长期的平均天数为(18±1.8)d,点阵组为(20.7±1.9)d,KGF-2组为(37.2±1.8)d,空白组为(44.7±2.8)d,治疗组之间及治疗组与空白组相比差异均有统计学意义(P<0.05)。结论 CO_2点阵激光及外用KGF-2凝胶都有促进小鼠毛发周期性再生的作用,且两种治疗方法结合应用的作用优于单独使用,但其作用机制有待于进一步研究探讨。

拟南芥双油体蛋白融合表达KGF-2及其生物学活性研究

目的:构建p1301-YO-K2-YO双油体KGF-2融合蛋白表达载体并转化拟南芥,与p1301-YO-K2单油体KGF-2融合蛋白表达载体对比,观察是否能够提高外源蛋白KGF-2的表达量,并对融合蛋白生物学活性进行鉴定。方法:PCR获得拟南芥油体蛋白oleosin和KGF-2核心区基因片段,融合PCR获得KGF-2-oleosin融合基因,与包含有一个oleosin的p1301-oleosin载体连接,构建p1301-YO-K2-YO(oleosin-KGF-2-oleosin)表达载体,利用农杆菌介导法将其转入拟南芥中进行表达,除草剂筛选获得转基因植株,通过PCR鉴定、SDS-PAGE、Western blot对KGF-2蛋白表达进行分析,提取油体蛋白涂抹法观察对C57BL/6小鼠的毛囊促生长作用。结果:双油体载体成功转入拟南芥基因组中;Western blot灰度分析可知,与单油体表达载体p1301-YO-K2相比,双油体融合表达策略可使KGF-2蛋白表达量提高2.5倍左右;动物实验结果表明油体融合蛋白具有良好的促毛囊增殖活性。

积雪甙对伤口愈合作用的基础研究

目的:探讨积雪甙治疗伤口愈合的影响。方法:采用MTT法测量积雪甙对角质形成细胞和血管内皮细胞株增殖作用的影响,采用RT-PCR方法测量积雪甙对血管内皮细胞分泌KGF- 2mRNA量的影响。结果:积雪甙在浓度为1.5μg/ml左右时对角质形成细胞和血管内皮细胞促增殖作用最大,在此浓度下血管内皮细胞KGF-2mRNA表达量最大。结论:积雪甙在浓度为1.5μg/ml对伤口愈合促进作用最大。

重组人角质化细胞生长因子-2发酵条件的优化及其活性

目的优化重组人角质化细胞生长因子-2(Recombinant human keratinocyte growth factor-2,rhKGF-2)基因工程菌的发酵条件,并对rhKGF-2进行纯化及活性检测。方法优化rhKGF-2基因工程菌接种量、装液量、培养基初始pH值、IPTG浓度、诱导时机和诱导时间等发酵条件;rhKGF-2经离子交换层析和肝素亲和层析后,采用MTT法检测其对NIH-3T3细胞增殖的影响。结果 rhKGF-2基因工程菌的最佳发酵条件为:接种量2.0%,装液量50ml/250ml三角瓶,培养基初始pH值6.5～7.0,IPTG浓度0.10mmol/L,菌体处于对数生长初期时(A600=0.8～1.0)开始诱导,诱导时间4h;纯化的rhKGF-2经HPLC检测纯度达95.0%以上;在1～100μg/ml浓度范围内,rhKGF-2对NIH-3T3细胞的增殖具有促进作用。结论优化了rhKGF-2基因工程菌的发酵条件,获得了纯度较高、具有活性的rhKGF-2蛋白,为其工业化生产奠定了基础。

重组人角质细胞生长因子-2基因的克隆和表达

目的 :克隆人KGF_2基因 ,并在大肠杆菌中进行表达。方法 :通过PCR扩增 ,从人胎肝cDNA文库中获得编码人KGF_2的cDNA ,并将其分别克隆入pBV2 2 0 ,pLEX和pGEX4T_1质粒中 ,研究其在不同表达质粒和大肠杆菌中的表达情况。结果 :克隆得到的KGF_2cDNA经测序证明与文献报道的序列一致。将其克隆于pBV2 2 0质粒中 ,在E .coliJM10 9中表达量相对最高 ,约占菌体总蛋白的 4 % ;克隆于pLEX质粒中 ,在E .coliGI72 4中的表达量约占全菌总蛋白的 5 % ;克隆于pGEX4T_1中 ,在E .coliJM10 9中的表达量可占到全菌总蛋白的 2 0 %。结论 :采用GST融合蛋白表达质粒pGEX4T_1对KGF_2进行表达 ,较pBV2 2 0和pLEX具有明显优势 ,能实现对KGF_2的高效表达 ,为进一步的功能研究奠定了基础。

角质细胞生长因子2突变体对小鼠放射性肠黏膜损伤的治疗研究

目的研究角质细胞生长因子2(keratinocyte growth factor-2,KGF-2)突变体对放射性肠黏膜损伤的治疗作用。方法将无特定病原体(specific pathogen free,SPF)C57BL/6J雌性小鼠随机分为模型组(A组)、静脉注射KGF-2突变体组(B组)、KGF-2突变体加骨髓移植组(C组)和单纯骨髓移植组(D组),用γ射线放射源60Co对小鼠进行单次全身照射,总剂量为12 Gy,另设正常对照组(E组)。通过分析小鼠照射后30 d存活率,照射后72 h小肠组织病理变化、凋亡与自噬情况,阐述KGF-2突变体对放射性肠黏膜损伤的治疗效果。结果 A组照射后9 d内小鼠全部死亡,C组30 d仍有70%存活。HE染色显示,C组小肠组织各级结构最为完整,免疫组化发现C组小肠隐窝处自噬水平升高,凋亡水平降低。结论 KGF-2突变体对放射性肠黏膜损伤有显著的治疗作用。