采用磁微粒分离酶联免疫法构建基于KGN细胞的雌激素生物合成筛选模型

雌激素在机体生长发育中发挥着重要作用,其合成代谢紊乱会导致乳腺癌和骨质疏松等疾病发生。目前,基于细胞的雌激素合成筛选模型需用到放射性底物,对环境污染大,成本较高,限制了具有组织特异性调控雌激素合成的药物筛选。我们以高表达芳香化酶的KGN细胞为检测对象,比较基于聚苯乙烯酶联免疫法和磁微粒分离酶联免疫法的雌二醇ELISA试剂盒的交叉反应和灵敏度,发现相对于聚苯乙烯酶联免疫法,磁微粒分离酶联免疫法能够稳定高效的检测雌激素合成。进一步比较培养基中酚红和底物睾酮对雌二醇检测的影响,成功建立通过磁微粒酶联免疫法检测KGN细胞雌二醇合成的筛选模型。

microRNA-130a抑制KGN细胞FOXL2基因的表达及对细胞增殖的影响

目的:研究外源性microRNA-130a在卵巢颗粒细胞KGN中过表达对FOXL2基因表达的影响,探索microRNA-130a对KGN细胞增殖的影响。方法:人工设计合成靶向FOXL2基因的microRNA-130a模拟物,脂质体法将microRNA-130a模拟物转染入KGN细胞中,Trizol法和RIPA蛋白裂解法分别获取高纯度的细胞总RNA和总蛋白,实时荧光定量聚合酶联反应(FQ-PCR)检测microRNA模拟物转染后细胞中FOXL2基因mRNA表达水平,Western Blot检测FOXL2蛋白表达水平,四甲基偶氮唑盐法(MTT)检测microRNA-130a转染后KGN细胞的增殖情况。结果:成功转染KGN细胞后,阴性对照组FOXL2基因mRNA和蛋白的表达水平与空白对照组相比无明显的差异(P>0.05),mi R-130a转染组能显著抑制FOXL2 mRNA和蛋白的表达,与空白对照组和阴性对照组相比均有统计学差异(P<0.05)。MTT法检测各组KGN细胞的OD值及细胞增值率,microRNA-130a转染后能明显促进KGN细胞的增殖,与与空白对照组和阴性对照组相比均有统计学差异(P<0.05)。结论:外源性的mi R-130a对FOXL2基因mRNA和蛋白表达有明显的抑制作用,且能明显促进KGN细胞的增殖。

京尼平对脂多糖诱导的KGN细胞株炎性反应的影响研究

目的研究不同质量浓度京尼平对脂多糖诱导的人卵巢颗粒细胞系(KGN细胞株)炎性反应的影响。方法2018年9月,用脂多糖诱导KGN细胞株炎性反应,24h后分别加入不同质量浓度(0、0.05、0.10、0.20、0.30mmol/L)京尼平,设置空白对照组(添加相应剂量溶剂二甲基亚砜的DMEM/F12培养基)、脂多糖组和脂多糖+0.05、0.10、0.20、0.30mmol/L京尼平组。采用CCK-8法检测KGN细胞株的活性;采用酶联免疫吸附试验检测各组上清液中雌激素水平,以及白细胞介素-4(IL-4)、IL-5、IL-1β、IL-6的表达;蛋白质印迹法检测各组17α羟化酶(CYP17A1)、芳香化酶(CYP19A1)、线粒体解偶联蛋白2(UCP2)、核因子κB(NF-κB)蛋白表达。结果与空白对照组比较,高质量浓度(≥0.10mmol/L)京尼平对KGN细胞株生长具有明显抑制作用,差异均有统计学意义(P<0.05);低质量浓度(≤0.05mmol/L)京尼平对KGN细胞株生长无明显影响,与空白对照组比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。脂多糖诱导的KGN细胞株IL-4、IL-5、IL-1β、IL-6表达,以及UCP2、NF-κB蛋白表达均明显增加,差异均有统计学意义(P<0.05);脂多糖诱导的KGN细胞株用高质量浓度京尼平干预后IL-4、IL-5、IL-1β、IL-6表达,以及NF-κB蛋白表达均明显降低,差异均有统计学意义(P<0.05);UCP2、CYP17A1、CYP19A1蛋白表达变化均不明显,差异均无统计学意义(P>0.05);各组雌激素水平比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。结论脂多糖能诱导KGN细胞株发生明显的炎性反应,京尼平对炎性反应具有明显的抑制作用,并伴随NF-κB蛋白表达的下降而更明显。而京尼平在炎性状态下可能不影响雌激素的分泌。

双酚A暴露对KGN细胞m6A修饰水平的影响

目的研究双酚A(BPA)暴露对卵巢颗粒细胞功能表观遗传学的影响。方法将人卵巢颗粒瘤细胞(KGN细胞)暴露于BPA(浓度分别为0、0.02、0.2、2、20μg/mL)24 h,作为溶剂对照组、0.02μg/mL BPA组、0.2μg/mL BPA组、2μg/mL BPA组、20μg/mL BPA组,测定mRNA m6A的修饰水平和m6A甲基化调控基因的表达变化;Merip-qPCR法检测抗氧化转录因子(Nrf2)的m6A修饰水平。结果BPA下调mRNA m6A修饰水平(P<0.001),并改变了m6A甲基化调控基因的表达(P<0.05),2μg/mL BPA组的超氧化物歧化酶(SOD)表达降低(P<0.05),Nrf2的m6A修饰水平降低(P<0.05)。结论BPA暴露通过下调Nrf2的m6A修饰导致人卵巢颗粒瘤细胞(KGN细胞)氧化应激增加,颗粒细胞功能损伤,对卵巢颗粒细胞表观遗传学产生影响。

缺氧诱导因子-1α对人卵巢颗粒细胞KGN能量代谢的影响及作用机制研究

目的:探究缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)对人卵巢颗粒细胞KGN能量代谢的影响及作用机制。方法:将KGN细胞随机分为KGN组(细胞不做任何处理),si-NC组(转染阴性对照si-NC)和si-HIF-1a组(转染siRNA si-HIF-1a)。利用实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)检测HIF-1a、线粒体DNA(mtDNA)及己糖激酶(HK2)的mRNA表达;蛋白质免疫印迹法(western blotting)检测HIF-1α蛋白表达;细胞计数试剂盒(CCK-8)检测各组细胞的增殖活力;流式细胞术检测各组细胞凋亡情况;细胞外通量分析仪测量细胞外酸化率;线粒体超氧化物(MitSOX)荧光染色检测各组细胞内的线粒体活性氧(ROS)含量;5,5’,6,6’-四氯-1,1’,3,3’-四乙基苯并咪唑基碳氰碘化物(JC-1)荧光染色检测各组细胞膜电位;三磷酸腺苷(ATP)检测试剂盒检测各组细胞内ATP含量。结果:低表达HIF-1a可以降低KGN的细胞增殖活力(P<0.01),增加细胞的凋亡率(P<0.01);同时细胞外酸化率显著增加(P<0.01),而糖酵解关键酶HK2表达显著下降(P<0.01);细胞内线粒体中ROS含量显著增加(P<0.01),相对膜电位及ATP含量显著下降(P<0.01)。结论:低表达HIF-1a降低KGN细胞糖酵解能力及上调线粒体ROS含量致线粒体受损,最终影响KGN细胞的生长。

脱氢表雄酮能促进体外人卵巢颗粒细胞——KGN细胞的凋亡

目的观察脱氢表雄酮(dehydroepiandrosterone,DHEA)对体外人卵巢细胞——KGN细胞株凋亡的影响。方法用不同剂量的DHEA(0.01 mmol/L、0.1 mmol/L、1 mmol/L、10 mmol/L)处理体外培养的KGN细胞,以不加DHEA为阴性对照组,然后分别用CCK-8法和流式细胞术检测KGN细胞的活性和凋亡情况;并通过实时荧光定量逆转录-多聚酶链反应(real-time fluorescent quantitative reverse transcriptase polymerase chain reaction,q RT-PCR)检测雄激素受体(androgen receptor,AR)、B淋巴细胞瘤-2(B-cell lymphoma-2,BCL-2)和BCL-2相关X蛋白(BCL-2 associated X protein,BAX)基因m RNA的表达水平;通过蛋白免疫印迹(Western blotting)检测AR、BCL-2、BAX、细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases,ERK)及磷酸化ERK(P-ERK)的表达水平。结果与阴性对照组相比,经DHEA处理的KGN细胞的活力显著下降(P=0.000),而且随着DHEA剂量的增加,KGN细胞的凋亡率也随之提高,其中10 mmol/L DHEA干预组的凋亡率与阴性对照组相比,差异具有统计学意义(P=0.019);用不同浓度DHEA处理KGN细胞后,细胞中BCL-2蛋白的表达水平随着DHEA浓度的增加逐渐降低,其中10 mmol/L DHEA干预组与阴性对照组相比差异有统计学意义(P=0.007);与阴性对照组相比,0.1 mmol/L和10 mmol/L DHEA干预组细胞中BCL-2 m RNA的表达水平也显著降低(P=0.007,P=0.012);而细胞中AR和BAX的表达水平无显著变化(P>0.05);此外,虽然DHEA干预组KGN细胞中ERK蛋白的表达水平与阴性对照组相比,差异无统计学意义(P>0.05),但P-ERK蛋白的表达水平随着DHEA浓度的增加逐渐降低,其中10 mmol/L DHEA干预组细胞中P-ERK蛋白的表达水平显著降低(P=0.005)。结论 DHEA能抑制KGN细胞的生长而促进其凋亡,并伴随着细胞中BCL-2蛋白和P-ERK蛋白表达水平的下降。

Wnt5a激活c-Jun氨基末端激酶(JNK)促进KGN人颗粒细胞增殖和自噬

目的 探究无翅基因5a(Wnt5a)对KGN人颗粒细胞自噬的作用。方法 采用Wnt5a重组蛋白(rWnt5a)、抑制剂IWP2和BOX5处理KGN人颗粒细胞并设置对照组,Western blot法检测Wnt5a蛋白表达水平,免疫荧光细胞化学染色法观察rWnt5a组和抑制剂IWP2组中Wnt5a蛋白和颗粒细胞特异性标志物叉头盒L2(FOXL2)的表达共定位。CCK-8法检测KGN细胞的增殖能力,Western blot法检测rWnt5a及其抑制剂IWP2对KGN细胞自噬的影响以及c-Jun氨基末端激酶(JNK)和活化T细胞核因子1(NFAT1)蛋白的表达变化。结果 与对照组相比,rWnt5a组Wnt5a蛋白水平增加,促进细胞增殖,微管相关蛋白1轻链3(LC3)、 JNK、 NFAT1蛋白表达增加,核孔蛋白62(P62)蛋白表达降低;IWP2组Wnt5a蛋白水平降低,抑制人颗粒细胞增殖,LC3、 JNK和NFAT1蛋白表达降低,P62表达增加。结论 Wnt5a激活JNK促进KGN人颗粒细胞的增殖和自噬。

β-谷甾醇通过PI3K/AKT通路影响颗粒细胞增殖及凋亡

目的探讨β-谷甾醇对人卵巢颗粒细胞系(KGN)增殖、凋亡及P-PI3KCA、P-AKT和Caspase-3蛋白表达的影响。方法体外培养KGN细胞,分为对照组和β-谷甾醇处理组,CCK-8测定添加10、20、40和80μmol·L^(-1)β-谷甾醇的KGN细胞的增殖情况以及20μmol·L^(-1)β-谷甾醇的KGN细胞在12、24、36和48 h细胞的增殖情况;流式细胞术检测细胞凋亡及周期分布,细胞免疫荧光检测KGN细胞内P-PI3KCA、P-AKT和凋亡家族Caspase-3蛋白定位和分布,Western blot检测PI3K/AKT/mTOR通路关键蛋白P-PI3KCA、PI3K、AKT、P-AKT和凋亡家族Caspase-3蛋白表达。结果CCK-8结果显示,与对照组相比较,添加20μmol·L^(-1)β-谷甾醇作用于KGN细胞,在24 h细胞分裂增殖能力增强(P<0.01);细胞周期结果显示,添加20μmol·L^(-1)β-谷甾醇处理24 h后KGN细胞周期显示G0/G1期细胞所占比例减少,S+G2/M期细胞所占比例增加;细胞凋亡结果表明,β-谷甾醇处理组KGN细胞总凋亡率低于对照组(P<0.05);细胞免疫荧光显示,P-PI3KCA、P-AKT和Caspase-3在KGN细胞胞核和胞质有表达,Western blot结果显示,β-谷甾醇处理组KGN细胞中P-PI3KCA、P-AKT蛋白相对表达量上调,Caspase-3蛋白表达下调(P均<0.05)。结论β-谷甾醇可促进颗粒细胞增殖,抑制凋亡,其机制与PI3K/AKT信号通路有关。

二甲双胍对IFN-γ诱导的人卵巢颗粒细胞损伤的保护作用

目的:探讨二甲双胍对干扰素(interferon,IFN)-γ诱导的人卵巢颗粒细胞KGN功能损伤的效应及可能机制。方法:采用CCK-8法检测不同浓度二甲双胍单独及与IFN-γ共处理对KGN细胞活力的影响,并观察细胞生长状态的变化;流式细胞术检测不同处理对KGN细胞凋亡及周期的影响;q-PCR法检测细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂1A(cyclin dependent kinase inhibitor 1A,CDKN1A)mRNA的表达。结果:IFN-γ可抑制KGN细胞活力、阻滞细胞从G0-G1期进入S期,并促进凋亡(P <0.05);二甲双胍单独处理几乎不影响KGN细胞功能;但二甲双胍与IFN-γ共同作用可提高损伤的KGN细胞活力,缓解IFN-γ引起的细胞凋亡及周期阻滞,并抑制细胞周期负性调节蛋白CDKN1A表达的异常上调。结论:二甲双胍可减轻IFN-γ诱导的KGN细胞功能损伤,并且可能是通过下调细胞周期负性调节蛋白CDKN1A的异常表达发挥保护作用。

17β-雌二醇对卵巢颗粒细胞增殖转移的影响及作用机制

目的探究17β-雌二醇(17β-E_2)对卵巢颗粒细胞增殖、转移的影响及其作用机制。方法体外培养卵巢颗粒细胞系—KGN细胞,采用MTT法检测17β-E_2对KGN细胞增殖的影响;划痕实验检测17β-E_2单独或和G蛋白偶联雌激素受体1(GPER1)特异性拮抗剂—G15共同处理对KGN细胞转移的影响;分别于17β-E_2单独或和G15共同处理KGN细胞0 min、10 min、30 min及60 min后收集细胞,采用Western Blot法检测细胞ERK1/2的磷酸化水平。结果 MTT结果显示,17β-E_2对KGN细胞增殖无显著影响;划痕实验结果表明,17β-E_2单独处理能够显著抑制KGN细胞的转移,而联合G15处理对细胞转移则无显著影响;Western Blot结果显示,17β-E_2单独处理细胞10 min、30 min及60 min后,细胞ERK1/2磷酸化水平均显著降低;而17β-E_2和G15共同处理细胞不同时间后,细胞ERK1/2磷酸化水平相比于处理前无显著性变化。结论 17β-E_2能够显著抑制KGN细胞的转移,其机制与GPER1介导的雌激素非基因组效应有关。