肺腺癌中可变剪接调控因子KHSRP调控的差异剪接基因分析

背景与目的:可变剪接在细胞增殖、生长、凋亡及分化等复杂的蛋白质功能调控中发挥着至关重要的作用,能参与包括肿瘤在内的多种疾病的发生、发展过程,目前大多数可变剪接调控因子的功能及其作用机制尚不清楚。本研究旨在探讨KH型剪接调控蛋白(KH-type splicing regulatory protein,KHSRP)在肺腺癌中的差异剪接靶基因及靶基因的表达与患者预后及免疫细胞功能的相关性。方法:通过高通量可变剪接测序,筛选KHSRP下游差异剪接靶基因。通过肿瘤免疫评估资源(Tumor IMmune Estimation Resource,TIMER)和阿拉巴马大学伯明翰分校癌症数据分析门户(the University of Alabama at Birmingham cancer data analysis portal,ULCAN)分析KHSRP下游差异剪接靶基因在肺腺癌中的表达。通过Kaplan数据库分析KHSRP下游差异剪接靶基因的表达与患者预后的相关性。通过TIMER免疫模块分析KHSRP下游差异剪接靶基因与免疫细胞功能的相关性。结果:NUMB、ADD3及LIMCH1为KHSRP的下游关键可变剪接靶基因。NUMB、ADD3及LIMCH1在肺腺癌肿瘤组织中均呈低表达,其低表达者预后不良。NUMB、ADD3及LIMCH1与免疫细胞功能呈正相关。结论:在肺腺癌中,NUMB、ADD3及LIMCH1为KHSRP的差异剪接靶基因,且NUMB、ADD3及LIMCH1低表达会导致预后不良,并且与免疫细胞功能呈正相关。

LINC00626通过JAK1/STAT3/KHSRP信号轴调控肺腺癌转移的恶性进展

目的探究长链非编码RNA 626(long intergenic non-protein coding RNA 626,LINC00626)通过JAK1/STAT3/KHSRP信号轴调控肺腺癌恶性进展及分子机制。方法采用实时荧光定量聚合酶链式反应(quantitative real-time polymerase chain reaction,q RT-PCR)检测非小细胞肺癌细胞系(A549、H1299、H1975、H1437)和人正常气管上皮细胞系(16HBE),以及144例肺腺癌组织标本及其正常组织标本中LINC00626、KH型剪接调控蛋白(KH-type splicing regulatory protein,KHSRP)m RNA的表达量。将敲降LINC00626慢病毒及其对照慢病毒转入H1299、H1437细胞中,分别命名为sh-LINC00626组(转染短发卡RNA慢病毒载体敲降LINC00626)和sh-NC组(转染短发卡RNA慢病毒空白载体)。将过表达LINC00626慢病毒及其过表达对照慢病毒转入A549、H1975细胞中,分别命名为LINC00626组和Vector组。在H1437细胞中加入敲降LINC00626慢病毒基础上的KHSRP载体和敲降LINC00626慢病毒基础上的空白载体,分别命名为sh-LINC00626+KHSRP组和shLINC00626+Vector组。采用细胞计数试剂盒-8、Transwell迁移/侵袭实验检测细胞增殖、迁移和侵袭等生物学特征,采用蛋白质印迹法检测稳定转染细胞中JAK/STAT、KHSRP蛋白的表达水平。裸鼠实验分析LINC00626在体内的作用。核质分离和RNA荧光原位杂交实验分析LINC00626和KHSRP的亚细胞定位。RNA下拉和质谱分析用于鉴定LINC00626的结合蛋白。结果与人正常支气管上皮细胞相比,LINC00626和KHSRP在非小细胞肺癌细胞系中表达水平均显著增加。与正常组织比较,LINC00626、KHSRP在肺腺癌患者组织中高表达。与sh-NC组相比,sh-LINC00626组细胞增殖率、细胞迁移、侵袭数明显降低,过表达组相应结果则反之。与sh-LINC00626+Vector组相比,sh-LINC00626+KHSRP组H1437细胞在转染敲降LINC00626和KHSRP后细胞增殖率、细胞迁移、侵袭数均明显增加。裸鼠实验中,与对照组相比,敲降组中肿瘤体积和重量、细胞增殖率和增殖指数、肺转移病灶数目明显下降;过表达组呈相反的效果,各组间差异均有统计学意义(P<0.01)。LINC00626和KHSRP位于细胞核内,LINC00626与KHSRP蛋白直接结合。与对照组相比,敲降组JAK1、STAT3 m RNA和蛋白的表达降低(P<0.05);与对照组相比,过表达组JAK1、STAT3 m RNA和蛋白的表达增加(P<0.05)。结论LINC00626通过JAK1/STAT3/KHSRP信号轴,促进肺腺癌的恶性进程。

KSRP对肝癌HepG2细胞增殖、周期及凋亡的影响

目的探讨KH型剪接调控蛋白(KSRP)对肝细胞癌(HCC)HepG2细胞增殖、周期以及凋亡的影响。方法使用GEO数据库探讨HCC患者的肿瘤组织及癌旁组织中KSRP的表达水平。实验分为3组:对照组、过表达组KSRP及敲低组shKSRP,使用慢病毒敲低或过表达KSRP,通过嘌呤霉素筛选敲低或过表达KSRP的稳定表达HepG2细胞系,Western blot检测HepG2中KSRP蛋白的表达水平;CCK-8法检测24h、48h、72h和96h时各组HepG2细胞增值率;采用流式细胞术和RNA-seq分别检测shKSRP以及对照组的HepG2细胞周期和抗原KI-67(MKI67)的表达;Annexin V-FITC/PI双染法检测shKSRP以及对照组的HepG2细胞凋亡情况。结果HCC患者癌组织中KSRP表达较癌旁组织升高(P<0.001);CCK-8法结果表明,敲低KSRP的HepG2细胞增殖明显减慢(P<0.01)。RNA-seq显示,KSRP敲低后可抑制MKI67基因的表达(P<0.05)。流式细胞术检测,KSRP敲低后,将HepG2细胞阻滞于S期(细胞周期),并可促使其凋亡,其凋亡率差异有统计学意义(P<0.05)。结论敲低KSRP可将HepG2细胞阻滞于S期,抑制细胞增殖,促进凋亡,这可能和下调KSRP与增殖相关基因MKI67的表达密切相关。