shRNA干扰A549细胞KIAA0101基因表达的初步研究

目的探讨小发卡RNA(small hairpin RNA,shRNA)真核表达质粒介导的RNA干扰技术对人肺腺癌A549细胞KIAA0101基因表达的抑制作用。方法应用pSIREN-RetroQ载体构建KIAA0101基因shRNA重组质粒,经脂质体法导入A549细胞,分别设置为空白对照组、阴性对照组、干扰A组和干扰B组,采用实时定量PCR法和免疫印迹(Western blot)法检测检测转染后细胞KIAA0101基因mRNA与表达蛋白质的变化,四唑盐(MTT)比色法测定各组干扰细胞活性。结果成功构建KIAA0101基因shRNA重组质粒,相对阴性对照组与空白对照组,干扰B组KIAA0101的mRNA与蛋白质表达水平均下降达70%(P≤0.05)以上,MTT法结果显示降低KIAA0101的表达可抑制肺癌细胞的生长活性。结论shRNA干扰质粒可以显著降低细胞内KIAA0101mRNA与蛋白质的表达水平,并且抑制癌细胞的生长活性,为该基因在肺癌中的深入研究奠定了基础。

KIAA0101调控胃癌细胞周期的相关基因筛选

目的筛选KIAA0101基因对细胞周期影响的相关基因。方法以RT-PCR方法分析胃癌组织相对于配对癌旁组织中KIAA0101基因表达量,利用DAVID数据库对差异基因进行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析,使用KEGG绘制通路图,将与KIAA0101表达模式相关的基因列表回带入TCGA cBioPortal进行基因之间相互网络作用的关系研究,并借由系统生成基因拓扑关系图。最后采用RT-PCR方法对候选基因进行筛选。结果癌组织中KIAA0101 mRNA表达水平为1.104±0.379,显著高于配对癌旁组织(0.421±0.172;P=0.0179)。系统通过汇总分析全部基因探针的表达强度,对来自478例组织中与KIAA0101相关的基因进行了筛选。GO功能分析显示差异基因主要富集在蛋白磷酸化、RNA加工、细胞周期、DNA代谢过程、蛋白质转运、乙酰化、细胞凋亡、蛋白质水解、氧化还原等功能。KIAA0101表达水平的改变主要影响的胃癌相关通路有:细胞周期、剪接体、DNA复制、p53信号转导通路等。KEGG通路图及基因拓扑图显示,BUB1B、MAD2L1、CDC45、CDK1、CCNE1、CCNB2等与KIAA0101相关的基因也与细胞周期相关,RT-PCR结果证实BUB1B、MAD2L、CDK1、CCNE1、CCNB2 mRNA表达水平显著高于配对癌旁组织(P<0.05),CDC45 mRNA表达水平无显著性差异(P>0.05)。结论 KIAA0101可能通过影响BUB1B、MAD2L1、CDK1、CCNE1、CCNB2表达产生对细胞周期的影响,这个结果可以为KIAA0101影响细胞周期的作用机制、肿瘤标志物的筛选和药物靶点的选择提供参考。

KIAA0101基因在人非小细胞肺癌中的功能预测

目的应用生物信息学分析方法对肺癌组织中高表达的基因KIAA0101进行功能预测与分析。方法通过dChip软件对人肺癌基因表达谱数据集中癌旁组织与癌组织两组样本进行比较,筛选出与KIAA0101基因共表达的差异基因。运用DAVID、GO、STRING等生物信息学软件对筛选基因进行生物学功能分析,并通过GATHER转录因子预测软件预测该组基因的共同转录因子。结果与癌旁正常组织比较,肺癌组织中KIAA0101等9个基因表达水平升高两倍以上,并且具有相似表达变化趋势;转录因子预测发现该组多数基因启动子区含有转录因子E2F1结合位点。结论筛选出人非小细胞肺癌组织中与KIAA0101基因共表达的一组基因,其中BUB1B、CDC20、CCNB2等基因与细胞周期的调节密切相关,推测KIAA0101基因可能参与肺癌细胞周期的调节,并且该组基因转录水平表达升高可能受转录因子E2F1的调控。

通过Crispr-cas9介导抑制KIAA0101基因可诱导肝癌细胞凋亡

目的构建肝癌细胞KIAA0101基因敲除的稳转株,研究抑制KIAA0101表达后肝癌细胞的细胞行为学改变。方法通过生物信息学筛选sgRNA,通过Crispr-cas9技术,构建抑制KIAA0101基因表达的sgRNA-cas9共转染慢病毒,并对KIAA0101基因敲除的实验组与空白对照组进行细胞增殖、凋亡、细胞周期及克隆形成实验。结果通过生物信息学筛选获得3条sgRNA,其中,sg1、sg3组具有明显的抑制KIAA0101基因表达的功能。通过crispr-cas9技术,获得了基于crispr-cas9技术介导的KIAA0101低表达的Huh-7肝癌细胞稳转株,结果显示,抑制KIAA0101基因表达后,相比对照组,实验组细胞增殖、迁移能力无显著变化,对细胞周期影响不显著(P>0.05),细胞凋亡率显著增加(P<0.05)。结论本研究通过Crispr-cas9技术,构建了Huh-7肝癌细胞KIAA0101基因敲除的稳转株,证实抑制KIAA0101基因表达后,Huh-7细胞凋亡显著增加。

小干扰RNA沉默KIAA0101的表达对皮肤鳞状细胞癌SCL-1细胞增殖和迁移的影响

目的探讨KIAA0101蛋白表达下调对皮肤鳞状细胞癌（SCC）SCL-1细胞增殖和细胞侵袭能力影响的分子机制。方法将KIAA0101siRNA和对照siRNA分别转染SCL-1细胞，将SCL-1细胞分为3组：未转染组、对照siRNA组和KIAA0101siRNA组。Western印迹检测3组细胞中KIAA0101蛋白的表达，CCK-8试剂检测细胞增殖，用Boyden小室检测细胞侵袭能力，Westem印迹检测细胞增殖和细胞侵袭相关蛋白的表达。结果KIAA0101siRNA组中KIAA0101蛋白的相对表达量为0．062±0．095，显著低于未转染组（0．359±0．044）和对照siRNA组（0．379±0．025），P〈0．05，SCL-1细胞的增殖和侵袭能力亦降低（P〈0．05）。此外，与未转染组和siRNA对照组相比，KIAA0101siRNA组中p21蛋白表达显著上升，而基质金属蛋白酶2表达显著下调（P〈0．05）。结论KIAA0101表达下调介导的SCL-1细胞增殖抑制和侵袭能力降低与p21和基质金属蛋白酶2表达变化相关。