慢病毒介导的KIAA1199表达下调对肝癌HuH-7细胞增殖和凋亡的影响及机制

目的研究慢病毒介导的KIAA1199表达下调对肝癌HuH-7细胞增殖和凋亡的影响及机制。方法肝癌HuH-7细胞感染LV3-KIAA1199 shRNA慢病毒,qRT-PCR和Western blotting测定下调效果,CCK-8法检测细胞增殖,流式细胞术测定细胞凋亡。Western blotting检测激活的Caspase-3(C-Caspase-3)、激活的Caspase-9(C-Caspase-9)、β-catenin、C-myc蛋白表达。用Wnt/β-catenin信号通路激活剂LiCl处理感染LV3-KIAA1199 shRNA慢病毒的肝癌细胞,检测细胞增殖、凋亡变化。结果感染LV3-KIAA1199 shRNA慢病毒的肝癌HuH-7细胞中KIAA1199 mRNA和蛋白水平均下降,细胞增殖活性降低,细胞凋亡率升高,细胞中C-Caspase-3、C-Caspase-9表达水平升高,β-catenin、C-myc蛋白表达水平下降。Wnt/β-catenin信号通路激活剂LiCl可以逆转下调KIAA1199对肝癌细胞增殖抑制和凋亡促进作用。结论慢病毒介导的KIAA1199表达下调通过阻断Wnt/β-catenin信号诱导肝癌HuH-7细胞增殖抑制和凋亡增加。

KIAA1199基因与肿瘤关系的研究进展

KIAA1199基因是HUGE蛋白质数据库中KIAA基因家族中的重要成员,其表达主要通过遗传和表观遗传机制调控,参与细胞内信号通路转导,具有调节细胞生长、分化、凋亡、运动等生物学行为的重要功能。研究发现KIAA1199基因与肿瘤的发生发展关系十分密切,是一种促癌基因,在多种类型肿瘤中表达上调,尤其是结直肠癌、胃癌、乳腺癌等肿瘤中明显上调,并可促进肿瘤细胞的增殖、黏附、侵袭及迁移等活动,重建肿瘤细胞与周围细胞及细胞外基质的联系,促进EMT进程。同时,KIAA1199基因与Wnt/β-catennin信号通路关系密切,是该通路的重要靶基因,并且可反馈调节该通路中重要复合体水平。由此认为KIAA1199基因可通过上述一系列机制促进肿瘤发生发展。

KIAA1199基因重组慢病毒载体的构建及在人胃肿瘤细胞MKN28中的表达

目的构建KIAA1199基因过表达的重组慢病毒载体,感染人胃癌细胞MKN28并使KIAA1199基因有效表达。方法将慢病毒载体GV367和KIAA1199基因序列用Age I和Nhe I双酶切、连接、筛选及测序获得重组慢病毒质粒GV367-KIAA1199。将测序正确的GV367-KIAA1199重组载体和辅助质粒Help1.0和Help2.0用Lipofectamine2000共转染293T细胞,得到重组慢病毒载体LV-KIAA1199。予荧光稀释法和药物筛选法测定重组慢病毒的感染滴度。以携带空白基因片段的慢病毒载体LV-NC为病毒对照组。将LV-KIAA1199和LV-NC以相同的病毒感染复数(MOI)分别感染人胃癌细胞株MKN28;荧光显微镜观察EGFP在细胞中的表达;实时定量PCR检测KIAA1199的m RNA在细胞中的表达水平。结果重组慢病毒载体LV-KIAA1199构建成功,LV-KIAA1199感染胃癌细胞后,荧光显微镜下可见细胞中呈现绿色荧光;KIAA1199的m RNA的表达均显著高于对照病毒组。结论重组慢病毒载体LV-KIAA1199可携带KIAA1199基因在人胃癌细胞株MKN28中进行有效过表达。

KIAA1199基因在消化系统肿瘤中的作用

KIAA1199基因是HUGE数据库中的重要成员之一,通过表观遗传学等机制参与细胞内信号通路的转导,调控细胞生长、分化、凋亡、迁移等活动。近年研究发现,KIAA1199基因与肿瘤的发生、发展关系密切,在人类多种肿瘤尤其是消化系统肿瘤中的表达均异常升高,具有促进肿瘤细胞增殖、黏附、侵袭、迁移等作用。本文就KIAA1199基因在消化系统肿瘤中的作用作一综述。

KIAA1199基因的研究进展

随着人类基因组学进入了后基因组计划,研究人类基因组所蕴藏的遗传信息,探索其具有的功能成为重要的方向之一。HUGE蛋白质数据库的建立正式这个方向的代表。它具有代表性的KIAA基因家族因其编码一些重要的蛋白而为人重视,其中KIAA1199基因因其与多种肿瘤的发生、发展密切相关而备受关注。本文就KIAA1199基因的结构、认识、研究新进展而作一综述。

KIAA1199和Ki67在胃癌组织中表达的相关性及其临床意义

目的分析胃癌(gastric cancer,GC)组织中KIAA1199和Ki67的表达及其与患者临床病理学特征及预后的关系,探讨KIAA1199在GC中的临床意义.方法回顾性分析2013年1月至2014年12月在武汉大学中南医院接受手术治疗的90例GC患者的组织和临床病理资料,通过免疫组织化学法检测KI-AA1199和Ki67在GC组织和癌旁正常组织中的表达情况,分析其表达水平与患者临床病理特征之间的关系,并采用Kaplan-Meier法和Cox回归模型探讨影响患者预后的相关因素.结果KIAA1199和Ki67在GC组织的表达均显著高于癌旁组织(P均<0.05),KIAA1199主要在胞浆中表达,而Ki67主要表达于胞核,两者的表达水平呈显著正相关(r=0.504,P<0.05).胃癌组织中KIAA1199的表达水平与肿瘤分化程度、淋巴结转移和TNM分期密切相关(P均<0.05),Ki67的表达水平与患者年龄、肿瘤分化程度和TNM分期显著相关(P均<0.05).生存分析显示,胃癌组织中KIAA1199的表达水平与患者的总生存期显著负相关(P<0.05),而Ki67的表达水平则与患者的预后无明显相关性(P>0.05).多元Cox回归分析显示KI-AA1199高表达是影响GC患者预后的独立因素(P<0.05).结论KIAA1199表达是影响GC患者预后的一个独立因素,在GC的术后预后评估方面具有潜在的临床应用价值.

胰腺导管腺癌中KIAA1199基因的表达及临床意义

目的探讨KIAA1199在胰腺导管腺癌(PDAC)中的表达及其临床意义。方法收集60例经术后病理确诊的PDAC组织及其中20例可获得的癌旁胰腺组织,进行免疫组织化学染色实验,检测石蜡切片中KIAA1199基因的表达情况,并分析其与相关临床病理因素及肿瘤术后存活时间之间的关系。同时运用Western blot和qRT-PCR实验检测10对新鲜冰冻PDAC标本和相应癌旁组织中KIAA1199的表达情况。结果KIAA1199在PDAC组织和癌旁组织中的阳性表达率分别为70.0%(42/60)和25.0%(5/20),差异有统计学意义(P<0.05)。统计学分析结果显示患者的淋巴结转移(P<0.05)、分化程度(P=0.010)、神经侵犯(P=0.016)、TNM分期(P=0.047)等临床因素和KIAA1199的表达密切相关(P<0.05);患者的年龄(P=0.206)、性别(P=0.515)和肿瘤位置(P=0.726)等因素和KIAA1199的表达并无显著相关(P>0.05)。运用Kaplan-Meier法进行生存分析,KIAA1199阳性患者的总生存期(OS)中位生存时间为13.5个月,阴性表达的OS中位生存时间为17个月;KIAA1199阳性患者无病生存期(DFS)中位生存时间为10个月,而表达阴性患者的DFS的中位生存时间为13.5个月,差异有统计学意义(P<0.05)。Western blot和qRT-PCR实验证实KIAA1199在PDAC组织中表达较癌旁组织表达高,差异有统计学意义(P=0.0001,P<0.0001)。结论KIAA1199基因在PDAC组织中高表达,与PDAC患者的病理分化程度、TNM分期、神经是否浸润、淋巴结有无转移密切相关,且与患者的预后生存时间有着密不可分的联系,KIAA1199可能作为未来预测PDAC的新的生物学标志物。

KIAA1199 induces advanced biological behavior and development of ovarian cancer through activation of the IL-6/STAT3 pathway

Recently,abnormal expression of KIAA1199 has been detected in Epithelial Ovarian Cancer(EOC).However,the underlined anti-ovarian cancer mechanism of KIAA1199 remains to be enlightened.In our study,we performed to elucidate the effects of KIAA1199 on the advanced biological behavior of EOC cells through activation of the IL-6/STAT3 pathway.Confirmed by immunohistochemistry,KIAA1199 was highly expressed in ovarian borderline and malignant epithelial tumors.A retrospective analysis found that EOC patients with low expression of KIAA1199 had a significantly higher 5-year survival rate than those with high expression.Mechanistically,IL-6 was used to stimulate EOC cells,and the expression of KIAA1199,STAT3 and p-STAT3 increased after IL-6 stimulation.These results could show that KIAA1199 is transcriptionally activated by IL6/STAT3 pathway,thereby accelerating the deterioration of EOC.KIAA1199 could also be used as a poor prognosis factor and potential target in treatment.

LncRNA TUG1通过miR-145/KIAA1199轴对结直肠癌细胞转移和上皮间质转化的影响

目的探讨长链非编码RNA TUG1(LncRNA TUG1)通过微RNA-145(miR-145)/KIAA1199轴对结直肠癌细胞转移和上皮间质转化(EMT)的影响。方法收集浙江省嘉兴市第一医院2020年8月至2021年2月经病理诊断证实的、术前未接受放化疗的30例结直肠癌患者癌组织及癌旁组织标本。RT-qPCR检测LncRNA TUG1、miR-145和KIAA1199在Colo320、HCT116、NCM460细胞及癌和癌旁组织中的差异表达;分析LncRNA TUG1和miR-145的作用靶点及相关性;检测LncRNA TUG1通过miR-145对Colo320细胞发展和KIAA1199表达的影响;分析TUG1、KIAA1199下调对Colo320细胞增殖、侵袭及EMT的影响。结果癌组织LncRNA TUG1、KIAA1199表达高于癌旁组织,miR-145表达低于癌旁组织(P<0.01)。HCT116、Colo320细胞中LncRNA TUG1和KIAA1199表达高于NCM460细胞,miR-145表达低于NCM460细胞(P<0.01)。TUG1下调组细胞活力(24、48、72 h),细胞侵袭数目低于下调对照组(P<0.05);TUG1下调组N-cadherin、Vimentin和Snail表达低于下调对照组,E-cadherin表达高于下调对照组(P<0.01)。LncRNA TUG1野生型+miR-145模拟物组荧光素酶活性低于LncRNA TUG1野生型+模拟物对照组(P<0.01);LncRNA TUG1突变型+模拟物对照组与LncRNA TUG1突变型+miR-145模拟物组荧光素酶活性比较,差异无统计学意义(P>0.05)。TUG1过表达+miR-145模拟物组细胞侵袭数目,细胞活力(24、48、72 h)高于过表达对照+miR-145模拟物组(P<0.05);TUG1过表达+miR-145模拟物组N-cadherin、Vimentin、Snail表达高于过表达对照+miR-145模拟物组,E-cadherin表达低于过表达对照+miR-145模拟物组(P<0.01)。KIAA1199下调组细胞活力(24、48、72 h),侵袭数目低于下调对照组(P<0.05);KIAA1199下调组N-cadherin、Vimentin、Snail表达低于下调对照组,E-cadherin表达高于下调对照组(P<0.01)。结论LncRNA TUG1通过miR-145促进KIAA1199表达,加速Colo320细胞增殖、侵袭及EMT。

KIAA1199在原发性肝细胞肝癌中的表达及其对肝癌细胞侵袭转移的影响

目的:探究KIAA1199在原发性肝细胞肝癌(HCC)中的表达及其对肝癌细胞侵袭转移的影响。方法:选择2015年1月至2019年12月收治的130例原发性肝细胞肝癌患者的癌组织及相对应的癌旁组织,免疫组化和蛋白质印迹法检测KIAA1199的表达水平,探究KIAA1199表达与患者临床病理参数及预后的关系;Transwell侵袭实验检测KIAA1199对肝癌细胞侵袭转移的影响。结果:(1)HCC组织中KIAA119阳性表达率为83.08%(108/130),高于其相对应的癌旁组织中KIAA119阳性表达率15.38%(20/130),差异有统计学意义(P<0.05)。(2)HCC患者中KIAA1199的蛋白阳性表达与有无肝硬化史,肿块数目、大小,分化程度,MVI,TNM分期及患者年龄有关(P<0.05);且KIAA1199的高表达会导致患者总生存率下降。(3)转移性高的MHCC97H细胞中KIAA1199表达最高,转移能力最低的Huh7细胞中KIAA1199表达最低。(4)KIAA1199过表达可以促进肝癌细胞的转移和侵袭。结论:KIAA1199与HCC的侵袭和转移等病理过程密切相关,KIAA1199的高表达增加了患者的死亡风险,也促进了肝癌细胞的迁移侵袭。

结直肠腺癌KIAA1199基因表达与临床病理学相关性

目的探讨KIAA1199基因在结直肠腺癌中的表达与临床病理特征及预后的相关性及临床意义。方法采用实时定量PCR法(qPCR)检测手术切除结直肠腺癌及癌旁正常组织KIAA1199 mRNA表达;采用免疫组织化学染色(IHC)检测结直肠腺癌组织蜡块KIAA1199蛋白原位表达;分别分析KIAA1199 mRNA、蛋白表达水平与患者临床病理特征及预后生存的相关性。结果结直肠腺癌组织KIAA1199 mRNA水平(2-△△Ct=42.410 6±1.060 5)明显高于癌旁正常组织(2-△△Ct=1)(P<0.01),结直肠腺癌组织KIAA1199 mRNA水平与患者年龄、淋巴结及远处转移、临床分期呈正相关(P<0.01),与患者生存期呈负相关(P<0.01);结直肠腺癌组织KIAA1199蛋白表达水平[83.00%(83/100)]明显高于癌旁正常组织(阴性)(P<0.01),结直肠腺癌组织KIAA1199蛋白表达水平与原发灶浸润深度及临床分期呈正相关(P<0.01),与患者生存期呈负相关(P<0.01)。结论 KIAA1199基因可作为一种较有价值的评估结直肠腺癌病程进展及预后的标志物。

靶向抑制KIAA1199基因的表达对人结肠癌细胞SW620生长的影响

目的探讨靶向沉默KIAA1199基因的表达对人结肠癌SW620细胞生长能力的影响。方法运用RNA干扰(shRNA)技术构建携带靶向抑制KIAA1199分子的慢病毒载体LV3-KIAA1199-shRNA并感染人结肠癌细胞株SW620为实验组(shKIAA1199),携带无义序列的对照慢病毒载体LV3-NC-shRNA为阴性对照组(shNC),未转染的细胞为空白对照组(MOCK)。72 h后用荧光显微镜观察慢病毒的感染效率,RT-PCR法验证慢病毒感染后KIAA1199 mRNA在MOCK、shNC和shKIAA1199各组细胞中的表达水平,并用嘌呤霉素筛选KIAA1199静默和阴性对照的稳转细胞。用MTT法检测MOCK、shNC和shKIAA1199各组细胞活力,流式细胞仪分别检测三组细胞的凋亡率和细胞周期的变化。结果携带靶向干扰KIAA1199基因的慢病毒感染人结肠癌细胞株SW620后,能有效下调KIAA1199在细胞内的表达水平并成功筛选KIAA1199静默的SW620稳转细胞;与MOCK和shNC组比较,shKIAA1199组细胞活力减少(P<0.05),细胞凋亡率明显升高(P<0.05),处于细胞周期中G1期的细胞数量比例明显下降(P<0.05),G2/M期细胞比例增加(P<0.05)。结论下调KIAA1199基因的表达可抑制SW620细胞的增殖,促进该细胞的凋亡,使该肿瘤细胞的生长周期受到阻滞。

KIAA1199基因沉默对肺腺癌细胞A549增殖和迁移侵袭影响

目的 KIAA1199作为致癌基因在很多癌症中高表达。本研究探讨干扰KIAA1199基因表达对肺腺癌细胞A549细胞增殖、迁移和侵袭的影响。方法设计合成KIAA1199siRNA并通过蛋白质印迹法检测KIAA1199siRNA的干扰效率。CCK-8实验和Transwell实验检测KIAA1199基因表达被干扰后对肺腺癌细胞A549增殖、迁移和侵袭的影响。结果 KIAA1199基因沉默后,表达量在对照组(1.547±0.026)、KIAA1199siRNA#1组(0.506±0.011)和KIAA1199siRNA#2组(0.498±0.018),KIAA1199siRNA#1组(P=0.003)和KIAA1199siRNA#2组(P=0.002)均低于对照组,差异有统计学意义。CCK-8检测发现对照组细胞增殖活性第3天(20.8±1.5)、第4天(30.7±2.3)和第5天(42.7±3.9),KIAA1199siRNA#1组的细胞增殖活性第3天(15.5±1.1)、第4天(20.8±2.1)和第5天(33.8±4.1),均低于对照组,且差异均有统计学意义,t3d=5.270,P3d=0.001;t4d=4.227,P4d=0.001;t5d=5.412,P5d=0.001。KIAA1199siRNA#2组细胞增殖增殖活性第3天(15.0±0.7)、第4天(20.6±3.1)和第5天(31.8±3.2),均低于对照组,且差异均有统计学意义,t3d=7.690,P3d=0.001;t4d=6.572,P4d=0.001;t5d=5.367,P5d=0.001。Transwell迁移结果显示,细胞迁移数目对照组(121.34±24.51)、KIAA1199siRNA 1#组(69.73±9.45)和KIAA1199siRNA 2#组(65.78±10.04)3组间比较差异有统计学意义,F=15.627,P<0.001;KIAA1199siRNA 1#组(t=8.172,P=0.005)和KIAA1199siRNA 2#组(t=6.538,P=0.004)均少于对照组,且差异有统计学意义。Transwell侵袭结果显示,细胞侵袭数目对照组(63.51±2.32)、KIAA1199siRNA 1#组(30.23±3.14)和KIAA1199siRNA 2#组(26.08±2.01),3组间比较差异有统计学意义,F=13.548,P<0.001;KIAA1199siRNA 1#组(t=5.790,P=0.003)和KIAA1199siRNA 2#组(t=4.529,P=0.004)均少于对照组,且差异有统计学意义。KIAA1199siRNA 1#组和KIAA1199siRNA 2#组的上皮标志物E-cadherin表达上调,而间质标记物Vimentin和N-cadherin表达下调。结论 KIAA1199在肺腺癌组织中高表达,并与患者的生存预后呈负相关。下调KIAA1199基因的表达抑制肺腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭。

KIAA1199基因表达与胃癌临床病理学相关性

[目的]探讨K1AA1199基因在胃癌中的表达与临床病理特征及预后的相关性，以明确KIAA1199基因在胃癌中的临床意义。[方法]采用实时定量RT-PCR方法检测手术切除胃癌及癌旁正常组织中KIAA1199的mRNA表达；采用免疫组织化学染色方法检测胃癌组织中KIAA1199的蛋白原位表达；分析KIAA1199的mRNA表达水平与患者临床病理特征及预后的相关性。[结果]胃癌组织KIAA1199的mRNA水平明显高于癌旁正常组织（P〈0．05），胃癌组织中KIAA1199蛋白表达较癌旁正常组织亦升高。X2检验发现胃癌组织KIAA1199的mRNA水平与肿瘤分化程度、浆膜浸润、淋巴结转移及临床分期呈正相关（P〈0．05），与患者年龄、性别及远处转移无相关性。生存分析提示KIAA1199mRNA高表达组生存率明显低于低表达组（P〈0．05）。[结论]KIAA1199基因在胃癌中表达量升高，与胃癌的临床病理学及生存率密切相关，对评估胃癌病程进展及预后有一定指导意义。

KIAA1199在原发性肝癌中的表达及临床意义

目的观察KIAA1199在原发性肝癌中的表达及其临床意义。方法收集136例原发性肝癌患者癌组织及其配对的癌旁组织，采用免疫组化、Western印迹法检测KIAA1199的蛋白表达，并分析其与临床病理特征及预后的关系。结果原发性肝癌组织中KIAA1199阳性表达率为82．3％（112／136），高于其配对癌旁组织的阳性表达率14．7％（20／136），原发性肝癌组织中KIAA1199的高表达与患者年龄、肝硬化史、肿块大小、肿瘤数目、分化程度、TNM分期、微静脉侵犯（MVI）显著相关（P〈0．05），而与患者性别、饮酒史、肝炎史、家族遗传史、肿瘤部位无显著相关（P〉0．05）。经Kaplan—Meier法分析，KIAA1199在原发性肝癌中的高表达与患者总生存率的下降显著相关（P〈0．01）。此外，我们对其进行Cox比例风险模型统计分析，KIAAll99高表达与患者年龄、肝硬化史、肿块大小、肿瘤数目、分化程度、TNM分期、MVI等预后因素显著相关（P〈0．05）。结论KIAA1199在原发性肝癌组织中高表达，且与临床病理特征及预后密切相关，KIAA1199高表达显著增加了患者的死亡风险。

维吾尔族和汉族女性乳腺癌与KIAA1199基因表达调控的关系

目的探讨维吾尔族和汉族女性乳腺癌与KIAA1199表达调控的关系。方法收集维吾尔族和汉族女性乳腺纤维腺瘤、乳腺癌患者的石蜡包埋组织标本150例(维吾尔族68例,汉族82例),另选取新鲜组织标本58例(维吾尔族21例,汉族37例),采用免疫组织化学和逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法检测KIAA1199蛋白和mRNA表达水平。结果乳腺纤维腺瘤细胞中KIAA1199蛋白表达上调率为31.9%,乳腺癌细胞中KIAA1199蛋白表达上调率为76.7%,差异有统计学意义(P<0.01),维吾尔族、汉族女性乳腺癌KIAA1199表达上调率的变化趋势具有共性(维吾尔族2=12.30,P<0.01;汉族2=15.19,P<0.01),其族群差异无统计学意义(P>0.05)。KIAA1199基因的转录表达水平在乳腺癌组织中明显上调,其mRNA相对含量为0.967±0.281,乳腺纤维腺瘤组织中KIAA1199 mRNA含量为0.475±0.176,差异有统计学意义(P<0.01)。结论 KIAA1199表达上调伴随着乳腺病变进程,可能成为乳腺癌分子预警指标。

靶向沉默KIAA1199基因表达对人非小细胞肺癌A549细胞生物学行为的影响

目的探究靶向沉默KIAA1199基因表达对人非小细胞肺癌A549细胞生物学行为的影响。方法采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)和蛋白印迹(western blot)检测肺正常上皮细胞系BEAS-2B和肺癌细胞系(A549、H332和H1299)中KIAA1199 mRNA和蛋白的表达;以小干扰RNA(siRNA)技术沉默A549细胞中KIAA1199的表达,并经qRT-PCR和Weatern blot验证KIAA1199表达变化;CCK-8实验、流式细胞仪、Transwell小室和划痕实验检测细胞增殖、凋亡、侵袭和迁移能力,Weatern blot检测细胞中相关蛋白的表达。结果与正常上皮细胞系BEAS-2B比较,肺癌细胞系A549、H332和H1299细胞中KIAA1199 mRNA和蛋白的表达均升高(P<0.05);与空白组比较,KIAA1199-siRNA组KIAA1199mRNA和蛋白表达、细胞A值、穿膜细胞数和迁移率、细胞中PCNA、Cyclin D1、p-p38/p38、p-JNK/JNK及p-ERK1/2/ERK1/2表达均降低,细胞凋亡率和细胞中caspase-3和caspase-9蛋白表达增加(均P<0.05),但空白组和sc-siRNA组上述指标的比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论沉默KIAA1199基因表达可抑制A549细胞的增殖、侵袭与迁移,诱导其凋亡,可能与阻滞MAPK信号通路有关。

人KIAA1199蛋白表达、纯化、抗体制备及鉴定

目的 KIAA1199是一种功能未知的胞浆蛋白,通过制备多克隆抗体来为进一步研究其功能奠定基础。方法采用PCR技术扩增出目的基因,将其克隆到pMAL-C2X和pGEX-5X-1原核表达载体中。经IPTG诱导后,重组质粒pMAL-C2X/KIAA1199和pGEX-5X-1/KIAA1199,分别表达含麦芽糖结合蛋白(MBP)的MBP-KIAA1199融合蛋白和含重组谷胱甘肽转移酶(GST)的融合蛋白GST-KIAA1199。其中,MBP-KIAA1199融合蛋白经纯化后,免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体;GST-KIAA1199融合蛋白用于检测抗体特异性。此后应用ELISA及Westernblot方法鉴定该抗体。结果 pMAL-C2X/KIAA1199和pGEX-5X-1/KI-AA1199两个重组质粒构建成功,并获得了高效价的特异性多克隆抗体。结论成功制备了KIAA1199抗体,为进一步研究基因功能奠定了基础。

上调lncRNA TUG1靶向miRNA-194-5p促进KIAA1199表达对结直肠癌细胞增殖侵袭和EMT的影响

目的探讨上调长链非编码RNA牛磺酸上调基因1(lncRNA TUG1)靶向miRNA-194-5p/KIAA1199轴对结直肠癌细胞SW480增殖、侵袭和上皮间质转化(EMT)的影响。方法RT-qPCR检测该院病理确诊为结直肠癌并行肿瘤切除术的52例患者结直肠癌组织、癌旁组织及SW480、人正常结肠黏膜上皮细胞NCM460细胞中lncRNA TUG1、miRNA-194-5p和KIAA1199的表达。生物信息学软件预测TUG1可能结合的靶基因。分别下调lncRNA TUG1、miRNA-194-5p和KIAA1199在SW480细胞中的表达,RT-qPCR检测lncRNA TUG1、miRNA-194-5p和KIAA1199的基因表达水平,CCK-8法检测SW480细胞增殖能力,Transwell实验检测细胞侵袭能力,Western blot检测SW480细胞EMT相关蛋白表达水平。结果与癌旁组织比较,结直肠癌组织lncRNA TUG1、KIAA1199表达水平明显上调(P<0.01),miRNA-194-5p表达水平明显降低(P<0.05);与NCM460细胞比较,SW480细胞中lncRNA TUG1、KIAA1199表达水平明显上调,miRNA-194-5p表达水平明显降低,差异均有统计学意义(P<0.01)。生物信息学软件预测结果显示,lncRNA TUG1可靶向结合miRNA-194-5p。下调TUG1或KIAA1199表达后可明显抑制SW480细胞增殖、侵袭及EMT(P<0.05),下调miRNA-194-5p表达可促进SW480细胞增殖、侵袭及EMT(P<0.05),上调TUG1通过miRNA-194-5p可促进KIAA1199表达及SW480细胞增殖、侵袭及EMT。结论上调lncRNA TUG1通过miRNA-194-5p/KIAA1199轴可促进SW480细胞增殖、侵袭和EMT。

柚皮苷中药单体调节miR-216a基因对结直肠癌细胞增殖和凋亡的影响研究

目的探讨柚皮苷中药单体靶向调节miR-216a基因对结直肠癌细胞增殖、凋亡的影响及机制。方法qRT-PCR检测三株结直肠癌细胞(SW620、LOVO和HCT116)miR-216a和KIAA1199基因mRNA表达,Western blotting检测KIAA1199蛋白表达。双荧光素酶报告基因实验检测KIAA1199-WT/MUT与miR-216a mimics共转染后的荧光素酶活性,qRT-PCR及Western blotting检测miR-216a mimics/inhibitor转染SW620细胞后KIAA1199基因mRNA及蛋白表达。MTT、流式细胞术分别检测miR-216a、靶向KIAA1199及柚皮苷(0.4 mmol/L、0.8 mmol/L和1.6 mmol/L)对SW620细胞活力、凋亡的影响。qRT-PCR检测柚皮苷对miR-216a基因和KIAA1199基因表达的影响,Western blotting检测柚皮苷对KIAA1199蛋白表达的影响。结果三株结直肠癌细胞miR-216a基因表达明显降低,KIAA1199基因mRNA及蛋白表达均明显升高(P<0.05)。选择SW620细胞作为研究对象。过表达miR-216a可明显抑制SW620细胞活力,促进细胞凋亡(P<0.05),同时过表达miR-216a和KIAA1199可减弱过表达miR-216a对SW620细胞活力和凋亡的影响。不同浓度柚皮苷均可抑制SW620细胞活力,促进细胞凋亡,上调miR-216a基因表达,下调KIAA1199基因表达,呈剂量依赖性(P<0.05)。结论柚皮苷中药单体可引起miR-216a表达水平改变进而调控KIAA1199表达,从而影响结直肠癌细胞增殖和凋亡。