驱动蛋白Kif18A多克隆抗体的制备、纯化及免疫特异性检测

采用标签蛋白诱导表达纯化、蛋白质谱、Western Blot、免疫荧光染色等多种分子生物学与细胞生物学方法,探究了一种制备蛋白特异性多克隆抗体、检测抗体并且运用抗体获得蛋白翻译后修饰信息的实验思路.结果表明,使用这种方法可以高效地得到Kif18A的兔源多克隆抗体.得到的抗体血清可以很好地应用于Western Blot(蛋白免疫印迹)、Co-IP(免疫共沉淀)等分子生物学实验.将抗体血清纯化后可以应用于免疫荧光染色实验,并可以获得良好清晰的实验结果.此外,利用制备出的Kif18A特异性抗体对细胞内源性Kif18A进行Co-IP实验后进行质谱分析,得到了内源性Kif18A蛋白翻译后的修饰信息,为研究Kif18A蛋白的定位与功能奠定了良好的基础.

KIF18A杆状病毒表达系统的构建与鉴定

目的KIF18A蛋白是调节有丝分裂和影响肿瘤发生发展的重要蛋白，本研究旨在建立KIF18A蛋白昆虫杆状病毒表达系统，从而可在体外高效合成KIF18A蛋白。方法先用分子克隆方法构建转移载体，然后通过基因转座作用得到重组杆状病毒，最后将重组杆状病毒转入昆虫细胞Sf-9以高效合成KIF18A蛋白。结果经过DNA测序、倒置显微镜下细胞观测和WesternBlot检测验证分析，证实已成功建立了KIF18A蛋白昆虫杆状病毒表达系统。结论明确了KIF18A杆状病毒表达系统中转移载体构建和重组病毒转染等条件，建立了高效表达KIF18A的杆状病毒表达系统。

驱动蛋白分子Kif18A各功能域细胞定位的研究

目的探讨人驱动蛋白分子Kif18A的各功能域在真核细胞中的定位。方法构建驱动蛋白分子Kif18A野生型及各功能域(马达区、杆状区、尾区和马达区含部分杆状区)的绿色荧光蛋白表达质粒,分别转染人乳腺癌细胞MCF7,运用聚丙烯酰胺凝胶电泳和免疫印迹法验证各蛋白的表达,免疫荧光染色法分别对细胞进行微管蛋白和DNA染色,荧光显微镜下观察各绿色荧光融合蛋白的具体亚细胞定位。结果有丝分裂间期,Kif18A蛋白分子的马达区绿色荧光沿微管分布,尾区在细胞核和微管上均有分布,杆状区则散在分布在胞质中;有丝分裂末期,Kif18A的马达区仍沿微管分布,而马达区含部分杆状区主要集中在中体部位。结论 Kif18A蛋白分子的马达区和尾区与微管共定位;尾区含核定位序列;马达区和杆状区共同作用才能使该蛋白在有丝分裂末期定位于中体。