Kir2ds4基因RNAi慢病毒载体的构建与鉴定

本研究旨在构建kir2ds4基因RNAi慢病毒载体。针对已经筛选确定的kir2ds4基因RNAi有效靶序列,合成靶序列的OligoDNA,退火形成双链DNA,与经HpaI和XhoI酶切后的pSicoR-GFP载体[含U6启动子和绿色荧光蛋白(GFP)]连接产生LV-shkir2ds4慢病毒载体,应用PCR筛选阳性克隆并进行测序鉴定。用LV-shkir2ds4,包装系统质粒共转染包装细胞293T细胞,产生慢病毒颗粒,以293T细胞GFP蛋白的表达水平测定病毒滴度。结果表明,PCR和测序结果证实成功地构建了kir2ds4shRNA的慢病毒载体LV-shkir2ds4。293T细胞测定病毒滴度为6×108TU/ml。结论:成功地构建了人kir2ds4基因RNAi慢病毒载体。

KIR2DL4-IgFc融合蛋白基因真核细胞表达载体的克隆及鉴定分析

目的 构建人KIR2DL4-IgFc段融合蛋白基因真核细胞表达载体。方法 用RT-PCR从孕妇蜕膜组织单个核细胞的总mRNA中逆转录扩增KIR2DL4胞外段cDNA,经Nhe I和Bam HI双酶切后,定向插入真核细胞表达载体CD51negl中,然后经酶切和测序鉴定。结果 限制性内切酶酶切和序列分析表明已成功构建CD51negl-KIR2DL4载体。结论 本研究成功构建KIR2DL4-IgFc融合蛋白真核细胞表达载体,为研究KIR2DL4与其配体之间的关系奠定了基础。

慢病毒介导RNA干扰心房区心肌细胞Kir2.2基因对Kv2.1钾通道及内向整流钾电流的影响

目的探讨慢病毒介导RNA干扰心房区心肌细胞Kir2.2基因对Kv2.1钾通道及内向整流钾电流的影响。方法构建携带Kir2.2基因干扰RNA的慢病毒载体(pGCSIL-Kir2.2-siRNA),并转染大鼠心房区心肌细胞,采用荧光显微镜观察携带报告基因GFP的慢病毒载体(pGCSIL-GFP-siRNA)在心肌细胞的转染情况,根据实验设计分为三组:Control组(不行慢病毒转染)、Ad-siRNA-null组(仅行空慢病毒转染)和Ad-siRNA-Kir2.2组(行pGCSIL-Kir2.2-siRNA慢病毒转染)。分别采用RT-PCR和Western印迹检测三组的Kir2.2基因的mRNA及Kv2.1钾通道的蛋白水平,采用膜片钳技术记录RNA干扰前后的心肌细胞内向整流钾电流(IK1)的变化情况。结果 pGCSIL-GFP/Kir2.2-siRNA慢病毒载体构建成功,且pGCSIL-GFP-siRNA转染心房肌细胞后,超过80%的细胞均可检测GFP(MOI=50),载体可正确表达;RT-PCR显示干扰后的细胞Kir2.2基因表达受到明显抑制,Ad-siRNA-Kir2.2组的Kir2.2基因的mRNA和Kv2.1钾通道的蛋白水平均下降,与其余两组相比均有差异(P<0.05);与Control组相比,Ad-siRNA-Kir2.2组的IK1减弱,电流密度降低,且电流-电压曲线上移,内向电流(-100 mV)和外向电流(-60 mV)均降低。结论慢病毒介导RNA干扰心房区心肌细胞Kir2.2基因可降低Kv2.1钾通道的表达并抑制内向整流钾电流。

KIR 2DL4基因测序分型中杂合碱基位置峰高不平衡现象及其意义

目的研究KIR 2DL4基因测序分型中序列及分型结果"异常"的原因。方法 2016年5月对KIR 2DL4基因测序分型时检出的2例杂合碱基位置峰高不平衡、判定为模棱两可结果或无完全匹配分型结果的标本,采集新鲜外周血样,提取mRNA,反转录成c DNA后,进行c DNA分子克隆和单体型测序;同时采用荧光定量法检测基因组DNA中2DL4基因的拷贝数。结果分子克隆和单体型测序表明,1例标本携带正常的KIR 2DL4*00102,*00501及*011等位基因;另一标本中检出了KIR 2DL4*00102,*00501及*00602等位基因。2例标本中均检出了3种不同的KIR 2DL4等位基因,无新等位基因检出。荧光定量PCR实验证实这2例标本KIR 2DL4拷贝数均为3个。结论人类KIR单体型上KIR 2DL4基因的拷贝数存在多样性,当出现杂合碱基位置峰高不平衡、无与之完全匹配分型结果,并非由新等位基因所致。

KIR2DL1基因多态性及其抗原表达关系的研究

目的本研究拟建立KIR2DL1基因分型和抗原分型技术,了解中国汉族人群KIR2DL1基因分布和抗原表达情况。方法收集166份新鲜外周血标本,分离单个核细胞,利用NK细胞特异性的CD56,和KIR2DL1特异性的CD158a抗体流式检测KIR2DL1抗原表达情况。提取标本的基因组,利用PCR-SSP技术检测KIR2DL1基因的有无,对于KIR2DL1基因阳性标本设计3对引物扩增1～9号外显子,并进行全长测序分析。结果1)166份标本中,164份标本KIR2DL1阳性,其中62份标本KIR2DL1和KIR2DS1双阳性,仅2份标本KIR2DS1单阳性。

Kir6.2基因E23K位点多态性与耐力训练后血糖、胰岛素和VO_2max改变的关系

目的:探讨Kir6.2基因E23K位点多态性与耐力训练所致的血糖、胰岛素和VO2max改变间的关系。方法:采用PCR-RFLP技术对214例美国各种族50至75岁男女受试者的Kir6.2位点E23K多态性进行基因型分析。受试者在专人监控下进行24周的耐力训练后,观察其E23K与血糖、胰岛素和VO2max之间的关系。结果:(1)三种基因型受试者的空腹血糖、胰岛素和VO2max的基础值无显著差异;(2)24周耐力训练后,三种基因型受试者的VO2max均显著升高(P<0.05),体重和体脂则显著下降(P<0.05),身高体重指数(BMI)和呼吸商(RER)则在男性各基因型中显著下降(P<0.05);(3)24周耐力训练后,三种基因型受试者的空腹胰岛素水平和曲线下面积(AUC)均显著下降(P<0.05),但训练并未引起空腹血糖及其AUC显著变化。(4)男性EK基因型RER显著低于EE和KK基因型,女性则表现为KK基因型显著高于EE基因型。结论:(1)无论E23K位点的基因型为EE、EK或KK,24周的耐力训练均可提高受试者的VO2max并降低体重、体脂、空腹胰岛素水平和AUC;(2)耐力训练对男性BMI和RER降低的影响更显著;(3)E23K多态性与RER的关系较VO2max和血糖水平更密切。

KIR2DL4基因多态性及促凋亡基因HtrA2在老年白血病病人中的表达及与预后的相关性研究

目的探讨KIR2DL4基因多态性及促凋亡基因HtrA2在白血病病人中的表达及与预后的相关性。方法选择2016年7月至2018年1月收治的老年白血病病人156例作为研究对象,设为观察组,其中急性淋巴细胞白血病(ALL)67例,急性髓系白血病60例,慢性髓系白血病(CML)29例,所有病人均给予常规方法治疗,随访2年。选择同期健康体检的老年人79例,设为对照组。完成基因组DNA提取,检测KIR2DL4基因分型;采用实时荧光PCR技术测定2组促凋亡基因HtrA2 mRNA水平;对KIR2DL4基因多态性及促凋亡基因HtrA2表达与老年白血病病人预后的相关性进行分析。结果2组KIR2DL4基因多态性中2DL4-001、2DL4-005、2DL4-006、2DL4-008、2DL4-0011差异无统计学意义(P>0.05);观察组9A型KIR2DL4高于对照组(P<0.05);10A型KIR2DL4低于对照组(P<0.05)。观察组HtrA2 mRNA水平高于对照组(P<0.05)。随访期间死亡54例,死亡率为34.62%。死亡组2DL4-0011、9A型KIR2DL4检出率均高于存活组(P<0.05),10A型KIR2DL4检出率和HtrA2表达水平低于存活组(P<0.05)。多因素Cox回归分析结果表明老年白血病病人预后与2DL4-006、9A型KIR2DL4基因多态性及HtrA2表达水平均有关(P<0.05)。结论KIR2DL4基因多态性及促凋亡基因HtrA2在老年白血病病人中表达异常,其水平与预后存在相关性。

MPTP诱导的帕金森病小鼠模型纹状体中Kir2基因的表达

目的研究1-甲基4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(MPTP)诱导的帕金森病(PD)小鼠模型纹状体中Kir2家族基因各亚型(Kir2.1、Kir2.2、Kir2.3、Kir2.4)mRNA的表达。方法构建MPTP诱导的5d亚急性PD小鼠模型,按造模病程设定时间点提取小鼠纹状体总RNA,用Kir2家族各亚型基因的特异性引物逆转录为cDNA,以荧光染料SYBR greenⅠ进行荧光实时定量PCR(real-time PCR),检测各特定时间点Kir2.1、Kir2.2、Kir2.3、Kir2.4mRNA表达。结果对不同时间点模型样本的real-timePCR检测发现,Kir2家族4种亚型基因在MPTP诱导的PD模型小鼠纹状体中均有不同程度表达,其中Kir2.3和Kir2.4mRNA随PD病程进展其表达量显著增加(P<0.05)。结论PD发病机制与纹状体Kir2家族Kir2.3、Kir2.4等亚型基因的表达可能有潜在联系。实验提示Kir2具有作为潜在PD研究靶点的可能性。

与HCV清除相关的KIR2DL3/HLA-C1基因组合在40例中国汉族健康人群中的分布

目的研究KIR2DL3/HLA-C1基因组合与丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus,HCV)清除的相关性。方法本研究对随机抽取的无血缘关系的40个健康成人(中国汉族)外周血样本进行了KIR及HLA-Cw基因分型,并分析了与HCV清除相关的KIR2DL3/HLA-C1基因组合的分布情况。结果 40例样本中HLA-Cw位点HLA-C1基因出现频率较HLA-C2高,且HLA-C1C1出现的频率较HLA-C1C2高;KIR基因型中,以3DL1、2DL1、2DL3、2DL4、3DL2、3DL3、2DP1、3DP1、2DS4出现频率较高,而3DS1、2DS1、2DS2、2DS3、2DS5、2DL2、2DL5出现频率较低;KIR2DL3+/HLA-C1C1例数较KIR2DL2+/HLA-C1C1多。综合分析发现,KIR2DL3+/HLA-C1基因型组合以KIR2DL3-2DL3/HLA-C1C1者较多,占总样本数52.5%。结论以本研究为基础,可进一步研究KIR2DL3/HLA-C1基因型组合与NK细胞体外抑制HCV活性的相关性,探讨HLA-Cw基因型为C1C1的个体中,KIR 2DL3-2DL3个体的NK细胞是否较2DL2-2DL2个体以及2DL3-2DL2个体的NK细胞具有更强的抑制HCV活性的作用,为丙型肝炎的免疫治疗及疫苗研制提供依据。

中国北方汉族人群KIR2DL4等位基因水平多态性的研究

目的了解中国北方汉族人群KIR2DL4等位基因水平的分子遗传多态性。方法采用磁珠法从327人份北方汉族无关个体标本中提取基因组DNA,采用本实验室建立的KIR2DL4测序分型专利技术对KIR2DL4基因的全部编码区(CDS)序列分为4段做特异性PCR扩增后,采用Sanger测序法对扩增产物所涵盖的每个外显子做双向测序。所获得的序列用Assign 4.7分析软件分析每个标本的基因型。结果共检出8种KIR2DL4等位基因,基因频率由高到低分别为KIR2DL4^(+)00102[77.1%(252/327)]、^(+)00501[35.8%(117/327)]、^(+)011[20.2%(66/327)]、^(+)00602[12.5%(41/327)]、^(+)00801[8.6%(28/327)]、^(+)00103[4.9%(16/327)]、^(+)00503[1.5%(5/327)]、^(+)00504[0.9%(3/327)]。能正常膜表达的10A型等位基因(KIR2DL4^(+)00102、^(+)00103、^(+)00501、^(+)00503、^(+)00504、^(+)00602)及存在CDS nt811位置腺嘌呤缺失而不能正常膜表达的9A型等位基因(KIR2DL4^(+)00801、^(+)011)的检出比例分别为97.6%(319/327)及27.8%(91/327),约为3.5∶1。与南方汉族人群相比较,中国北方汉族人群KIR2DL4各等位基因的检出频率无明显差异(P>0.05)。结论所获得的KIR2DL4分子遗传多态性数据可为疾病关联、人类进化等研究提供重要参考。

人KIR2DL1-Ig融合蛋白在COS-7细胞的表达

目的 :获得人KIR2DL1分子 (killerIg likereceptor 2DL1)胞外区与人IgGFc段的融合蛋白。方法 :从人外周血单个核细胞中提取总RNA ,通过RT PCR扩增编码KIR2DL1胞外段cDNA ,经NheⅠ和BamHⅠ双酶切后 ,定向插入真核细胞表达载体CD5lnegl中。构建的重组真核表达载体CD5lnegl KIR2DL1。经酶切分析和测序鉴定后 ,通过DEAE dextran/chloroquine法转染COS 7细胞。瞬时表达后 ,取培养上清液经亲和层析、ELISA、SDS PAGE及Western印迹 ,鉴定融合蛋白的表达及其免疫学活性。结果 :序列测定证实 ,该重组表达载体含有正确的KIR2DL1胞外区基因序列。重组真核表达载体CD5lnegl KIR2DL1转染COS 7细胞后 ,ELISA法检测细胞培养上清中有融合蛋白的表达。SDS PAGE结果显示 ,该融合蛋白的相对分子质量 (Mr)约为 730 0 0。Western印迹结果证实 ,该蛋白能被特异性单克隆抗体 (mAb)EB6所识别。结论 :KIR2DL1 Ig融合蛋白表达载体成功构建并在COS 7细胞中获得功能性表达 。

K_(ATP)通道Kir6.2亚基点突变体Kir6.2AAA在大鼠心肌细胞中的表达

目的制备含K ATP通道亚基点突变的重组腺病毒,并将其在大鼠心肌细胞中表达。方法针对Kir6.2位点的引物,利用Overlap PCR的方法定点突变Kir6.2的GFG氨基酸变成AAA,并将其克隆到pShuttle载体中进行序列分析,经PmeⅠ线性化、连接到腺病毒表达载体pAdEasy-1中,将pAdEasy-1包装进脂质体、转染入大鼠原代心肌细胞,并利用反转录PCR和Western blot法进行检测。结果成功制备了携带大鼠Kir6.2AAA及EGFP基因的重组腺病毒,病毒的滴度为2.64×1011VP/mL。荧光显微镜下可见Kir6.2AAA重组体腺病毒感染后的大鼠心肌细胞表达EGFP而发出绿色荧光,反转录PCR证实重组腺病毒载体Ad-Kir6.2AAA感染的心肌细胞中Kir6.2AAA的表达显著上调,Western blot法证明Kir6.2AAA在大鼠心肌细胞中过表达。结论成功构建了携带EGFP基因的Kir6.2AAA重组腺病毒载体并将其在大鼠心肌细胞中正确表达。

淋巴细胞的KIR2DL4基因表达在反复性胚胎停育主动免疫治疗前后的研究

目的检测复发性胚胎停育患者淋巴细胞主动免疫前后KIR2DL4基因的表达的变化,探讨反复性胚胎停育免疫学原因。方法选择2011年6月至2012年6月就诊的2次以上早孕胚胎停育的患者,根据以往有无人工流产和/或者分娩史分为无妊娠史(无人工流产及分娩史)组30例;有妊娠史(有人工流产史及分娩史)组55例;对照组为正常无妊娠史的未孕妇女30例。对研究者进行淋巴细胞主动免疫治疗4个周期后,采用荧光实时定量PCR技术检测治疗前后患者的淋巴细胞的KIR2DL4基因的表达。随访研究者妊娠结局。结果 (1)两组胚胎停育组治疗前KIR2DL4基因表达无妊娠史组为(43.55±12.71×103/ml)、有妊娠史组为(21.48±9.43×103/ml),分别与对照组(55.35±12.68×103/ml)比较,差异有统计学意义(P<0.05);两组胚胎停育组经淋巴细胞主动免疫治疗后KIR2DL4基因的表达分别为(56.76±10.90×103/ml、67.89±11.39×103/ml)与对照组治疗后(70.84±13.47×103/ml)比较,差异无统计学意义(P>0.05)。两组胚胎停育组免疫治疗前后比较KIR2DL4基因比较差异有统计学意义(P<0.05)。(2)免疫治疗前有妊娠史胚胎停育组KIR2DL4基因的表达(21.48±9.43×103/ml),与无妊娠史胚胎停育组KIR2DL4基因表达(43.55±12.71×103/ml)比较,差异有统计学意义(P<0.05),主动免疫治疗后差异无统计学意义(P>0.05)。(3)随访结果:两组胚胎停育组免疫治疗结束后,每组妊娠患者中,胚胎停育率分别为21.74%,18.75%;对照组胚胎停育率为20%。胚胎停育率比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论淋巴细胞KIR2DL4基因的表达数量异常与反复性胚胎停育有关。

中国汉族人群KIR2DL1高分辨等位基因分布频率及识别HLA—C配体的特点

目的研究中国汉族人群KIR2DL1高分辨等位基因频率及识别HLA-C配体的分布特点。方法采用基因测序和序列特异性引物聚合酶链反应（PCR—SSP）方法，对中华骨髓库登记的111例患者和116名无关供者，共计227份样本进行KIR2DL1高分辨等位基因分型和KIR基因分型，有105例患者接受异基因造血干细胞移植（allo—HSCT）。结果227份样本中有224份（98．68％）样本存在KIR2DL1基因，在448个等位基因中共发现3种KIR2DL1＊00302、＊00201、＊00401等位基因多态性，基因表型频率分别为84．82％（380／448）、12．05％（54／448）和3．13％（14／448），等位基因频率分别为61．04％、6．22％、1．58％，并与欧美人种基因频率分布差异有统计学意义。在6种KIR2DL1高分辨等位基因组合中KIR2DL1＊00302、00302（74．55％）纯合组合为最常见的基因型，且KIR2DL1＊00302、00401组合频率在A／A和B／x中的分布差异有统计学意义（P=0．001），含KIR2DLI＊00401的等位基因组合在A／A中无基因频率分布。KIR2DL1＊00302和KIR2DL1＊00201分别均与KIR2DS1、KIR2DL3、KIR2DS4和KIR3DL1／S1有连锁关系（P〈0．001）。在allo—HSCT的KIR／HLA受配体模式中KIR2DL1＊00302与HLA—C2组位点存在相关性，且与HLA—C＊06：02是最常见的识别受配体组合，而与HLA-C＊01：02受配体模式是最常见的产生异源反应活性的组合，二者在受配体模式中的分布差异具有统计学意义（P〈0．05）。结论KIR2DLI＊00302是中国汉族人群中最常见的等位基因，KIR2DLl高分辨基因分型可预测移植后供者NK细胞的异源反应活性并有利于供者的筛选。

KIR2DS4等位基因在无关全相合异基因造血干细胞移植中的作用

目的 研究中国南方汉族人群中KIR2DS4等位基因分布及2DS4基因对无关供者全相合造血干细胞移植（HSCT）的影响.方法 采用基因测序（Sequenee-based testing,SBT）和TOPO-TA 克隆相结合的方法 ,对接受HSCT的75对HLA-A、-B、-Cw、-DRB1、-DQB1高分辨全相合的供、受者进行KIR2DS4等位基因分型,150名供、受者均为中国南方汉族人群,75例受者中急性淋巴细胞白血病（ALL）29例,慢性粒细胞白血病（CML）24例,急性髓系白血病（AML）19例,其他恶性血液病3例.结果 150名供、受者中139例（92.7%）存在KIR2DS4基因,对2DS4基因全长测序后发现4个2DS4等位基因：KIR2DS4＊00101、＊003、＊004和＊007;109例（78.4%）存在2DS4＊00101;2DS4缺失型（具有1个或缺失2DS4＊00101基因）与完整型（具有两个2DS4＊00101基因）的存在比率为1：2;发现3个KIR2DS4新基因.当供者KIR分型为B/x（40例）时,移植后总体生存率明显高于供者为A/A组（35例）[RR=3.1（95%CI 1.1～8.6）,P=0.007];当供者为完整型（36例）时,移植后总体生存率低于供者为缺失型（39例）（P=0.031）;在A/A组中,当供者为完整型（14例）时,移植后急性移植物抗宿主病（GVHD）的发生率明显高于供者为缺失型（21例）[RR=9.0（95%CI 1.2～66.9）,P=0.010],并以Ⅲ～Ⅳ度aGVHD尤为明显（P=0.006）.结论 SBT与TOPO-TA基因克隆的高分辨分型方法可用于研究KIR基因家族多态性,并且移植前在HLA分型的基础上对供受者进行KIR2DS4基因分型,可能对临床选择合适的供者提供有利的依据.

KIR2DL4基因的多态性与南方汉族白血病的相关性研究

目的探讨南方汉族人群白血病与KIR2DL4等位基因多态性的相关性。方法提取南方汉族急性淋巴细胞白血病（acute lymphoblastic leukemia，ALL）（n=283）、急性髓系白血病（acutemyeloid[eukemia，AML）（n=227）、慢性髓系白血病（chronic myeloid leukemia，CMI。）（n=80）患者和306名南方汉族随机正常志愿捐血者的DNA基因组，应用本实验室自行设计的引物对KIR2DL4基因的全部8个外显子进行测序分型，用Assign4．7分析软件判定基因型。用SPSS13．0统计软件分别对检出的每个KIR2DIA等位基因、10A型等位基因和9A型等位基因的检出比例分别进行差异显著性分析，并进行P值校准（Pc）。结果ALL、AML、CMI，患者和正常对照均检出5种等位基因：KIR2DIA＊001、＊005、＊006、＊008、＊011。ALL病例组与对照组的KIR2DI．4＊011等位基因检出比例、10A型KIR2DL4等位基因检出比例的差异有统计学意义（KIR2DL4＊011：OR=1．66，P=0．01；10A型K琥2DIA：OR=0．42，P=0．03），但尸值经过校准后，差异均无统计学意义（Pc≥O．05）。AML、CML病例组分别与对照组检出的各个KIR2DL4等位基因、10A型等位基因和9A型等位基因的检出比例进行比较，组间比较差异均无统计学意义（P〉0．05、Pc〉0．05）。结论南方汉族ALL、AML、CML白血病与KIR2DL4等位基因多态性无显著关联。

KIR2DL1框架基因cDNA的分子克隆测序及一个新等位基因的鉴定

目的建立K工R2DLI框架基因cDNA的分子克隆测序方法，并鉴定南方汉族人群一个新的KIR2DL1等位基因。方法对-K豫2DL1框架基因测序分型结果异常的外周血样，提取mRNA，反转录为cDNA，用1对KIR2DLl框架基因特异性PCR引物进行扩增，特异性扩增产物（1．2kb）经切胶回收纯化后，进行分子克隆和单倍型测序。结果KIR2DL1特异性PCR扩增产物，经分子克隆和单倍型测序，检出1个正常的K／R2DL1＊00302等位基因和1个新变异的KIR2DL1等位基因。该新等位基因的序列与KIR2DL1＊00302最相近，但存在编码区nt 188A〉G点突变、位于第4外显子的第42密码子由GAG变成GGG，导致第42位氨基酸残基发生GIu42Gly改变；其序列提交GenBank（序列号：KP025960）和IPD-KIR数据库（IWS40001982），已被世界卫生组织HLA因子命名委员会KIR分委会正式命名为KIR2DL1＊031。结论我们建立了KIR2DL1框架基因cDNA分子克隆测序方法，在等位基因水平的KIR研究中具有广泛的应用前景。

南方汉族人群KIR2DL4基因的多态性及五个新等位基因的鉴定

目的研究南方汉族人群KIR2DL4基因的遗传多态性。方法采用自行设计的PCR引物对306名南方汉族无关个体K豫2DL4框架基因的8个外显子进行扩增，之后进行双向测序，用Assign3．5软件分析各样本的等位基因型。对与国际IPD-KIR数据库不完全匹配的样本进行cDNA分子克隆和单倍型测序。结果共检出11种KIR2DL4等位基因，其中KIR2DL4＊00503、＊00504、＊032、＊033、＊034被WHOHLA因子命名委员会KIR分委会正式命名为新等位基因。检出的等位基因及其频率分别为KIR2DL4＊00102（75．5％）、＊00103（8．2％）、＊00501（34．0％）、＊00503（0．7％）、＊00504（0．7％）、＊00602（14．4％）、＊00801（11．4％）、＊011（22．2％）、＊032（0．3％）、＊033（0．3％）和＊034（0．3％）。第7外显子CDSnt811位置正常的10A型等位基因（KIR2DL4＊00102、＊00103、＊00501、＊00503、＊00504、＊00602、＊032、＊033、＊034）和CDSnt811位置缺失腺嘌呤的9A型等位基因（K琥2DL4＊00801、＊011）的检出比例分别为97．0％及33．0％，约为2．9：1。结论获得了南方汉族人群KIR2DL4等位基因分子遗传多态性的基础数据，可为移植、生殖免疫、疾病关联研究及人类进化等提供参考。

转录因子E2F1调控KIR3DL1基因表达的分子机制

目的研究转录因子E2F1对KIR3DL1基因启动子转录活性的影响，明确其调控KIR3DL1基因表达的分子机制。方法采用PCR方法从K562细胞基因组DNA中扩增突变型KIR3DL1基因启动子序列，将产物连接到pGL3-Basic荧光素酶载体，构建报告重组子；采用染色质免疫共沉淀方法检测E2F1与KIR3DL1启动子在细胞内的结合；采用阳离子脂质体SuperFect包裹突变型和野生型KIR3DL1启动子-荧光素酶报告重组子，然后转染K562细胞，染色质免疫共沉淀方法检测E2F1与重组子在细胞内的结合，双荧光素酶检测试剂盒测定荧光素酶活性；将E2F1真核表达载体与野生型KIR3DL1启动子-荧光素酶报告重组子共转染K562细胞，双荧光素酶检测试剂盒测定荧光素酶活性。结果成功构建突变型KIR3DL1启动子-荧光素酶报告重组子，测序证实，在K562细胞KIR3DL1启动子区1个潜在的转录因子E2F1结合位点有1个自然发生的点突变（TTTGGCGC→TrCGGCGC）；E2F1完全不能与K562细胞中突变型KIR3DL1启动子结合，但能与NK-92MI细胞中没有突变的野生型KIR3DL1启动子结合；突变型KIR3DL1启动子-荧光素酶报告重组子保留了部分与E2F1的结合能力，但其相对荧光素酶活性较野生型降低了50％；共转染E2F1真核表达载体使野生型KIR3DL1启动子-荧光素酶报告重组子的相对荧光素酶活性增加为对照组的2倍以上。结论转录因子E2F1参与调控KIR3DL1基因转录激活，E2F1结合位点上CpG二核苷酸的数量和甲基化模式可能影响转录因子E2F1与靶序列的结合。

深圳汉族Kir6.2基因与2型糖尿病关系的病例-对照研究

目的研究深圳汉族人群钾离子内向整流通道Kir6.2基因多态性与胰岛素抵抗(IR)特征和2型糖尿病(T2DM)的关系。方法运用聚合酶链反应-变性梯度凝胶电泳(PCR-DGGE)技术对深圳市251例T2DM患者和170例非DM对照(NGT)人群的Kir6.2基因第一外显子E23K多态性进行分析,并对T2DM组不同基因型间临床及生化指标进行比较。结果 T2DM组与非DM对照组比较,Kir6.2基因型频率和等位基因频率分布差别均无统计学意义;T2DM组携带K等位基因者空腹血糖(FPG)、总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)及空腹血C肽(CP)水平显著高于携带E等位基因者(P<0.05)。结论深圳市汉族人群Kir6.2基因E23K多态性与2型DM患者胰岛素抵抗表型相关,但与T2DM的发生无明显关联。