人转化生长因子β3基因转染KLD-12自组装纳米肽纤维支架三维培养前软骨干细胞

背景:作者前期试验证实了外源性细胞因子人转化生长因子β3具有很强的诱导前软骨干细胞向成熟软骨分化并促进其增殖的能力。国外的研究均证实了在自组装肽纳米纤维支架中三维培养有利于软骨源性干细胞的增殖与分化。目的:将人转化生长因子β3基因转染于三维培养于KLD-12肽纳米纤维支架内的前软骨干细胞中,并比较其与二维培养前软骨干细胞转染效率的差异。方法:以免疫磁珠分选法获取并纯化前软骨干细胞,将其种植于KLD-12肽纳米纤维支架内,使用xfectTM stem纳米干细胞转染试剂将人转化生长因子β3基因分别转染入KLD-12三维支架内培养的前软骨干细胞和普通二维培养基培养的前软骨干细胞,通过免疫荧光和反转录-聚合酶链反应法测定转染后48h不同组别转化生长因子β3基因的表达情况,并利用酶联免疫吸附法测定转染后不同时间细胞培养上清液中转化生长因子β3的质量浓度。结果与结论:免疫荧光结果显示,KLD-12三维支架内培养的前软骨干细胞转染后转化生长因子β3阳性细胞率明显高于普通二维培养基内前软骨干细胞(P<0.05),与反转录-聚合酶链反应法检测结果相同。酶联免疫吸附法测定结果显示,转染24h前软骨干细胞上清液中转化生长因子β3蛋白水平呈上升趋势,72h后达到峰值,随后稍下降进入平台期。提示人转化生长因子β3基因在三维培养于KLD-12肽纳米纤维支架内前软骨干细胞中的转染效率高于普通二维培养基培养的前软骨干细胞。

兔纤维环细胞复合KLD-12多肽纳米纤维凝胶体外三维培养的实验研究

目的探讨兔纤维环细胞复合KLD-12多肽纳米纤维凝胶体外培养的可能性,寻找修复椎间盘退变的理想种子细胞和支架。方法胰蛋白酶消化法提取6月龄新西兰大白兔纤维环细胞,培养至第3代,复合于KLD-12多肽制备KLD-12多肽/纤维环细胞凝胶。倒置显微镜观察凝胶内细胞形态变化;细胞计数试剂盒8(cell counting kit 8,CCK-8)法检测细胞增殖活性;钙黄绿素(Calcein-AM)/碘化丙啶(propidium iodide,PI)双荧光染色观察凝胶内活、死细胞,计算活细胞比率;阿尔新蓝法检测培养基中糖胺聚糖(glycosaminoglycan,GAG)含量;免疫荧光染色观察Ⅱ型胶原分泌情况;实时荧光定量PCR(real-time fluorescence quantitative PCR,RT-q PCR)检测纤维环细胞Ⅱ型胶原及蛋白聚糖(Aggrecan)基因表达情况。结果复合于凝胶中的纤维环细胞呈圆形,少部分在凝胶边缘处贴壁的细胞呈多角形。CCK-8结果显示,细胞增殖活性随培养时间延长呈增加趋势,培养14 d活性显著高于其余各时间点(P<0.05),且各时间点活性均显著高于空白凝胶对照组(P<0.05)。Calcein-AM/PI双荧光染色观察示,培养5、14 d凝胶内细胞活细胞比率分别89.32%±8.58%和97.81%±1.09%,比较差异无统计学意义(t=—1.962,P=0.097)。GAG检测示,细胞中GAG含量随培养时间延长逐渐增加,8 d达峰值,之后逐渐下降;培养5、8、11 d时GAG含量显著高于2、14 d时(P<0.05)。免疫荧光染色示细胞中Ⅱ型胶原正常分泌。RT-q PCR检测示,培养5、14 d凝胶内纤维环细胞均可见Ⅱ型胶原和Aggrecan基因表达,14 d时基因相对表达量均显著高于5 d时(P<0.05)。结论纤维环细胞能够在KLD-12多肽纳米纤维凝胶中正常生长增殖,主要细胞外基质成分可正常表达,细胞生物活性良好。

KLD-12多肽/重组人BMP-2凝胶诱导兔BMSCs成骨活性的实验研究

目的探讨KLD-12多肽复合重组人BMP-2（recombinant human BMP-2, rhBMP-2）诱导兔BMSCs成骨活性的影响。方法取3月龄新西兰大白兔骨髓，采用密度梯度法分离培养BMSCs。取第3代BMSCs分别采用KLD-12多肽／rhBMP-2凝胶三维培养（实验组）和KLD-12多肽凝胶培养（对照组）。培养7d倒置相差显微镜下观察实验组细胞在凝胶内的形态；3、7、10、14、21d检测两组细胞培养基中ALP及骨钙蛋白含量；培养14d两组行I型胶原免疫荧光染色观察，实时荧光定量PCR检测I型胶原和骨钙蛋白基因相对表达量。结果倒置相差显微镜下观察，培养7d实验组及对照组凝胶内BMSCs呈圆形，分布均匀。两组培养3、7d时ALP表达量及骨钙蛋白含量比较差异无统计学意义（P〉0．05），10～21d实验组以上指标均明显高于对照组（P〈0．05）。培养14d。激光共聚焦显微镜观察示，实验组I型胶原免疫荧光染色阳性，且荧光强度较对照组高；实时荧光定量PCR检测实验组I型胶原、骨钙蛋白基因相对表达量均显著高于对照组，比较差异有统计学意义（t=15．902，P=O．000；t=12．998。P=0．000）。结论BMSCs在KLD-12多肽内正常生长并增殖，KLD-12多肽／rhBMP-2凝胶诱导BMSCs向成骨细胞分化的生物活性良好。