BTB-Kelch家族蛋白KLHL32参与炎症反应调控的初步分析

目的:克隆人BTB-Kelch家族蛋白KLHL32编码基因并初步鉴定其在细胞中的功能。方法:采用实时荧光定量PCR分析Toll样受体5(Toll-like receptor 5,TLR5)特异性激活剂鼠伤寒沙门菌鞭毛蛋白(flagllin from S.typhimurium,ST-FLA)刺激经佛波酯(phorbol 12-myristate 13-acetate,PMA)诱导分化的THP-1巨噬细胞中KLHL32 mRNA表达水平的变化,应用RT-PCR克隆人KLHL32编码区的cDNA序列并将其克隆至真核表达载体pcDNA3.1,采用萤光素酶双报告基因表达系统分析KLHL32过表达对转录因子核因子κB(NF-κB)活性的影响,并采用免疫共沉淀实验分析了KLHL32与Cul-3蛋白在细胞内的相互结合。结果:ST-FLA(100μg/L)刺激经PMA诱导分化的THP-1巨噬细胞4 h引起KLHL32 mRNA的表达水平下调;成功克隆了人KLHL32基因并将其克隆至真核表达载体中获得重组质粒pcDNA3.1-KLHL32-FLAG,在HEK293细胞中过表达KLHL32蛋白对TNF-α诱导的转录因子NF-κB激活没有明显影响,但KLHL32可通过其氨基端的BTB结构域与Cul-3相互结合。结论:成功鉴定了人KLHL32蛋白,其通过BTB结构域与Cul-3蛋白相互结合,可能是一种潜在的E3泛素连接酶,证实了TLR5受体激活可诱导其表达水平的下调,提示KLHL32蛋白在细胞中可能参与炎症细胞信号转导的调控。