CRISPR/Cas9介导的KLHL34基因敲除细胞系的建立及其应用

利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建KLHL34基因敲除的猪肾细胞系(PK-15),初步探究KLHL34对口蹄疫病毒(FMDV)复制的影响,为开展KLHL34功能研究和KLHL34调控病毒复制的分子机制提供试验材料。设计2条针对猪KLHL34基因的单向导RNA(single guide RNA,sgRNA),分别构建至载体PX459中;将PX459-KLHL34-sgRNA重组质粒转染PK-15细胞,经嘌呤霉素加压筛选、有限稀释法亚克隆挑取单克隆细胞,测序及Western-blot分析鉴定KLHL34基因的敲除情况。用FMDV感染鉴定后的KLHL34基因敲除细胞,利用间接免疫荧光试验、Western-blot、RT-qPCR和TCID50方法综合评价敲除KLHL34基因后对FMDV复制的影响。结果显示,敲除细胞中KLHL34基因发生了碱基缺失突变且引起了目的基因的移码,同时,敲除细胞中均未检测到KLHL34蛋白表达,表明成功构建了KLHL34基因敲除的PK-15细胞系;测定比较了FMDV在KLHL34基因敲除细胞系与对照细胞中的mRNA转录水平、病毒蛋白表达水平及病毒滴度,表明KLHL34基因敲除后显著促进了FMDV的复制。综上所述,本研究利用CRISPR/Cas9系统成功构建了敲除KLHL34基因的PK-15细胞系,首次证实KLHL34在抗FMDV复制过程中发挥着重要作用,为后续研究KLHL34调控FMDV复制的机制奠定了基础。