肠道病毒EV71相关受体在人二倍体细胞KMB17表面的构成分析

目的研究人二倍体细胞KMB17表面与肠道病毒EV71感染相关的受体Toll样受体4(TLR4)、血小板衍生生长因子受体α多肽(pDGFR-αR1)的表达情况,以及细胞周期、细胞代次、EV71感染对这两种受体表达的影响。方法使用荧光标记的特异抗体:PE-TLR4、FITC-PDGFR-αR1标记不同细胞代次、处于不同细胞周期时段的KMB17细胞,应用流式细胞仪检测表达这两种受体蛋白的阳性细胞率,以及EV71感染前后,阳性细胞率的变化。使用NCBI primer blast设计TLR4、PDGFR-αR1特异的引物,提取不同细胞代次、细胞周期时段KMB17细胞的RNA,使用real-timePCR检测这些受体蛋白特异mRNA的量。结果 KMB17细胞在使用血清饥饿法进行G0/G1同步化后约22h进入S期,在36h进入G2期,在48h左右完成分裂。PDGFR-αR1、TLR4平均阳性细胞的比例分别为4.47%和11.82%;通过流式细胞仪检测,在G0/G1期,PDGFR-αR1、TLR4的平均阳性细胞比例分别为4%和8.9%;在S期,分别为2.6%和9%;在G2/M期,分别为4.4%和13.5%;EV71病毒感染后,PDGFR-αR1阳性的细胞比率由2.6%上升至4.0%,TLR4阳性细胞比率分别为11.6%和12.8%。结论人二倍体细胞KMB17表面表达肠道病毒相关的受体TLR4和PDGFR-αR1,表达PDGFR-αR1的阳性细胞较TLR4少,不同代次的KMB17细胞这2种受体阳性细胞比例的差异不大,PDGFR-αR1阳性细胞在G0期较多,TLR4阳性细胞在G2/M期较多;EV71病毒感染后,PDGFR-αR1、TLR4阳性细胞的比率变化不大,表明这两种受体分子在KMB17细胞表面表达较稳定,不受EV71感染的影响。

^(99)Tc^m-N(NOEt)_2在KMB17人胚肺二倍体细胞与不同种类肺癌细胞中的摄取动力学比较

背景与目的PET/CT显像价格昂贵,因此研究适合SPECT/CT的肿瘤显像剂显得尤为重要。99Tcm-N(NOEt)2[99Tcm-氮-二(N-乙基-N-乙氧基二硫代氨基甲酸盐)]可被肺肿瘤细胞等摄取。本文旨在细胞水平对比研究其在KMB17人胚肺二倍体成纤维细胞与多种肺癌细胞中的摄取动力学差异,探讨99Tcm-N(NOEt)2显像对肺肿瘤的鉴别诊断价值。方法在等体积且细胞浓度为1×106/mL的YTMLC个旧人肺鳞癌细胞、SPC-A1人肺腺癌细胞、AGZY低转移人肺腺癌细胞、973人高转移肺腺癌细胞、GLC-82个旧人肺腺癌细胞以及KMB17人胚肺二倍体成纤维细胞的混悬培养液中分别加入等量99Tcm-N(NOEt)2,按300μL精确取样分装于试管中,37oC恒温培养,均分别于5min、15min、30min、45min、60min、75min、90min离心沉淀,测定细胞内放射性计数,计算各时间点各种细胞对99Tcm-N(NOEt)2的摄取百分率。结果6种细胞除SPC-A1细胞与973细胞之间的差异无统计学意义外(LSD-t检验,P=0.838),其余两两之间的差异均有统计学意义(P<0.001);细胞的摄取率大小关系为:973与SPC-A1>YTMLC>GLC-8->AGZY>KMB17;30min-45min时摄取率逐渐趋于平稳,45min摄取率均大于其摄取峰值的96.6%。结论99Tcm-N(NOEt)2显像在肺肿瘤的鉴别诊断中有一定的临床应用价值,且早期显像在30min左右是适合的。

应用KMB17细胞培养柯萨奇病毒B族1、2、3型的研究

目的 采用人胚肺二倍体细胞(human embryonic lung diploid cell)KMB17株对柯萨奇病毒B族(Coxsackievirus B,CVB)1、2、3型进行适应性培养,探索应用KMB17细胞培养CVB1-3型病毒的相关参数,为基于KMB17细胞研发CVB多价疫苗提供参考。方法 将CVB 1-3型分别设置8个不同的感染复数(mulitiplicity of infection, MOI)梯度(0.05、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.35、0.4),在KMB17细胞上进行培养观察,对病毒培养结果进行统计分析。结果 CVB 1-3型病毒均能KMB17细胞中复制,并使细胞产生明显的细胞病变(cytopathic effect, CPE)。其中CVB 1型在KMB17细胞上适宜的种毒MOI值为0.25~0.3,病毒收获液的平均滴度为7.25 lgCCID50/mL,适宜MOI范围内病毒培养时间的95%置信区间为96.1~97.6 h;CVB 2型在KMB17细胞上适宜的种毒MOI值为0.20~0.25,病毒收获液平均滴度为7.375 lgCCID50/mL,适宜MOI范围内病毒培养时间的95%置信区间为74.8~76.8 h。CVB 3型在KMB17细胞上适宜的种毒MOI值为0.30~0.35,病毒收获液的平均滴度为7.25 lgCCID50/mL,适宜MOI范围内病毒培养时间的95%置信区间为82.7~84.7 h。结论 KMB17为一株理想的用于CVB1、2、3型培养的基质细胞,可为基于KMB17细胞研发CVB多价疫苗提供参考。

人用疫苗生产用人二倍体细胞株KMB17的鉴定

目的鉴定本所自主建立的人用疫苗生产用人二倍体细胞株KMB17的正确性。方法用染色体核型检查法和短串联重复序列(short tandem repeat,STR)基因分型法对本所疫苗生产用人二倍体细胞株KMB17进行鉴定。将疫苗生产用KMB17细胞经秋水仙素处理,积累中期相染色体后,低渗条件下释放出染色体,吉姆萨染料染色制片,镜检,观察染色体结构,精确计数100个细胞的染色体数目;选取人源细胞的20个STR位点对KMB17细胞进行DNA分型,并将获得的STR图谱与ATCC和DSMZ数据库进行比对分析。结果高倍镜下观察可见,样品细胞染色体组结构正常,无缺失和突变;精确计数100个细胞中,染色体数为46的细胞数有84个,无染色单体和染色体断裂细胞,无结构异常细胞,亚二倍体细胞14个,超二倍体细胞数2个。STR基因分型获得的特征性图谱清晰,未出现三单位基因,在ATCC和DSMZ数据库中均未找到与其细胞分型完全匹配的细胞株。结论本所自主建立的疫苗生产用人二倍体细胞株KMB17的细胞染色体结构和数目均正常,不存在污染和交叉污染,为正确细胞株。

1株柯萨奇病毒A组10型毒株在KMB17细胞上的遗传稳定性分析

目的分析柯萨奇病毒A组10型毒株在人胚肺二倍体细胞(KMB17)上增殖的遗传稳定性。方法将V6-19/XY/CHN/2017毒株适应于KMB17细胞,并连续传代培养至15代。分别提取适应前及适应后第5、10、15代病毒RNA,分段对全基因组序列进行RT-PCR扩增、测序及拼接,利用Maga 7.0、Geneious 6.1.4等软件进行系统进化及同源性分析。结果命名该KMB17细胞适应株为K6-19/XY/CHN/2017,各子代病毒感染性滴度为7.25~7.75 lgCCID_(50)/mL。适应前后4个子代病毒的全基因核苷酸和氨基酸序列同源性分别为99.99%~100%和99.95%~100%。适应前与适应后第5、10代毒株均无核苷酸和氨基酸序列突变,第15代毒株VP4区域发生1个核苷酸突变(VP4172 A→G)及1个氨基酸突变(VP458 Ile→Val)。结论CV-A10能较好地适应KMB17细胞,K6-19/XY/CHN/2017在KMB17细胞上适应后可保持较高的病毒滴度和遗传稳定性,为后续疫苗研发奠定了实验基础。

KMB_(17)细胞培养流感病毒的实验研究

探讨了流感病毒在KMB17细胞上培养的可行性.将3株不同型别的流感病毒(A/Wisconsin/67/2005H3N2,A/New Caledonia/20/1999 H1N1和B/Malaysia/2506/2004)分别接种于KMB17细胞上,在无血清的条件下于不同pH值和不同胰酶浓度的维持液中35℃培养72 h后收获病毒,测定血凝效价.实验结果表明,所用的3个毒株中的H3N2亚型毒株(A/Wisconsin/67/2005 H3N2)血凝效价明显高于另外的H1N1亚型(A/NewCaledonia/20/1999 H1N1)和B型(B/Malaysia/2506/2004)毒株.因此认为KMB17细胞可作为培养流感病毒的备选培养基质.

重组人成纤维细胞生长因子21慢病毒质粒的构建及鉴定

目的构建人成纤维细胞生长因子21(human fibroblast growth factor 21,h FGF21)重组慢病毒质粒,并进行包装和鉴定。方法 PCR扩增人FGF21 ORF序列,经Eco RⅠ和Bam HⅠ双酶切后,连接至慢病毒载体PLV-EF1a-EGFP[2A]Puro,构建重组慢病毒质粒PLV-EF1a-EGFP[2A]Puro-h FGF21,经293T细胞包装为重组慢病毒颗粒,并感染KMB17靶细胞。荧光显微镜观察293T细胞中报告基因EGFP的绿色荧光,判断重组慢病毒的感染效率;RT-PCR法检测KMB17靶细胞中h FGF21基因m RNA的转录;免疫荧光和Western blot法检测KMB17靶细胞中h FGF21蛋白的表达。结果重组慢病毒质粒PLV-EF1a-EGFP[2A]Puro-h FGF21经双酶切及测序鉴定,证明构建正确,在包装细胞中获得较高的转染效率,重组慢病毒感染KMB17靶细胞72 h后,荧光显微镜下可见EGFP绿色荧光。感染组KMB17靶细胞中存在h FGF21基因m RNA的转录和蛋白的表达。结论成功构建了重组慢病毒质粒PLV-EF1aEGFP[2A]Puro-h FGF21,并于KMB17靶细胞中表达,为FGF21功能与特性的相关研究及基因工程药物的探索和研发奠定了基础。

不同细胞对柯萨奇病毒A组10型毒株的敏感性及滴度检测影响因素分析

目的探讨不同细胞对柯萨奇病毒A组10型(coxsackievirus A10,CV-A10)毒株的敏感性和滴度检测影响因素,为临床样品分离、病毒培养及保存使用提供基础数据。方法10株已在非洲绿猴肾(African green monkey kidney,Vero)细胞分离并培养2代的CV-A10毒株,检测其在Vero细胞、人胚肺二倍体细胞(human embryonic lung diploid cell,KMB17)、人横纹肌肉瘤(human rhabdomyosarcoma,RD)细胞及人喉癌细胞(human laryngeal carcinoma cell,HeP-2)上的感染性滴度,并对毒株进行蚀斑纯化和冻融处理。结果CV-A10毒株均能适应Vero细胞、KMB17细胞及RD细胞,不能适应HeP-2细胞。RD细胞上第1天即开始病变,第4天达到增值高峰,感染性滴度最高,达到7.75 lgCCID50/ml;KMB17细胞上病变最慢,第3天发生病变,第5天达到增值高峰,滴度为4.85 lgCCID50/ml。毒株在37℃放置3 d感染性滴度明显下降,4℃放置3 d,-30℃和-80℃放置30 d感染性滴度均无影响。结论RD细胞是CV-A10毒株最敏感的细胞,HeP-2细胞不敏感。CV-A10毒株反复冻融次数不宜超过5次,保存温度越低越好并避免4℃和常温下长时间放置。

细胞工厂制备F基因型腮腺炎减毒活疫苗工艺初步研究

目的:初步建立以人二倍体细胞KMB 17为培养基质的F基因型腮腺炎减毒活疫苗细胞工厂工艺。方法:分别使用细胞工厂和细胞培养瓶,以含体积分数5%和10%牛血清的培养基将KMB 17细胞培养至单层后计数,并按不同感染复数(multiplicity of infection,MOI)接种F基因型腮腺炎病毒,观察细胞病变情况,初步确定细胞工厂工艺最适MOI和病毒收获时间。在无血清培养基条件下,对两种生产工艺制备的腮腺炎减毒活疫苗半成品和成品进行病毒滴度检测、热稳定性试验及其他相关质量指标的检测。结果:在细胞工厂中获得了生长状态良好的KMB 17细胞,经洗涤后,在MOI为0.020时,培养7~9 d后可获得滴度较高的病毒收获液,经过滤、冻干,成品病毒滴度较稳定,其他质量指标经检测均符合中国药典2015年版三部的要求。结论:初步建立了细胞工厂制备F基因型腮腺炎减毒活疫苗的生产工艺。