利用降落PCR扩增KMT-1基因

用试剂盒提取一株牦牛源多杀性巴氏杆菌(C47-8)基因组DNA,同时应用降落PCR和普通PCR扩增KMT-1基因片段。结果表明:降落PCR法扩增出KMT-1基因片段的特异性条带与目的片段长度一致,普通PCR法没有结果。相同的反应体系,降落PCR程序能明显提高PCR的特异性,可用于扩增普通PCR难以扩增的基因片段。

牦牛源多杀性巴氏杆菌LAMP检测技术的初步建立

参考已发表的多杀性巴氏杆菌KMT-1基因保守区设计LAMP引物,以牦牛多杀性巴氏杆菌PMqh-10株为对象,建立了用于检测牦牛多杀性巴氏杆菌的环介导等温扩增方法。结果显示,63℃水浴锅中反应50 min即可观察到阳性结果,dNTP的最适浓度是1.8mmol/L,Mg2+最适浓度是12 mmol/L。方法特异性检测结果显示,该方法对随机选用的其他菌无扩增作用。

青藏高原牦牛出血性败血症菌落PCR快速诊断技术研究

为了探索一种快速、特异和敏感的牦牛出血性败血症诊断方法,本研究建立了针对多杀性巴氏杆菌种特异性KMT1基因的菌落PCR方法。结果显示:该方法的阳性检出率达到40.48%(51/126),高于传统细菌分离鉴定方法 28.57%(36/126);其能检出1 pg的DNA,并且特异性好、灵敏度高,对大肠埃希氏菌等3株对照菌均未扩增出253 bp的特异性条带。表明该方法可用于兽医临床和基层进行牦牛出血性败血症的快速诊断,具有较强的临床应用价值。

安格斯牛源多杀性巴氏杆菌的分离及其种特异性基因的克隆与序列分析

为了研究引起青海省海西州漠河骆驼场安格斯种牛致死病因及其病原特征,试验以C47-8为质控菌株,采用常规细菌分离鉴定技术对无菌采集的病死安格斯种牛病料进行了多杀性巴氏杆菌的分离与纯化、生化鉴定、致病性试验、药敏试验及其种特异性基因Kmt-1的检测。结果表明:临床分离株为革兰氏阴性的短杆菌,病料触片经美蓝染色镜检可见其呈两极着色特性;与C47-8间存在乳糖、蔗糖、木糖、水杨苷及尿素酶等5种生化鉴定差异;对小鼠具有致死性效应;对红霉素等22种抗生素耐药,平均耐药率为62.85%(22/34),而质控菌株则无耐药性。同时对提取的临床分离株DNA进行Kmt-1基因的PCR扩增,分别获得了大小为460 bp和253 bp的Kmt-1基因扩增片段;经序列分析,临床分离株Kmt-1基因与Gen Bank公布的序列之间的基因编码区核苷酸序列同源性为97%~100%;检测的最低DNA浓度为790 ng/m L;所应用的2对Kmt-1基因检测引物对伤寒沙门氏菌、大肠埃希氏菌和克雷伯氏菌的扩增均为阴性。说明此次安格斯种公牛发病为多杀性巴氏杆菌引起,建议该养殖场在做好饲养管理的同时,应加强针对多杀性巴氏杆菌的免疫预防和消毒处理措施,以减少或杜绝本病的再次发生。