亚胺培南联合头孢他啶对产KPC-2酶肺炎克雷伯菌的体外抗菌效果

目的探讨亚胺培南联合头孢他啶对产KPC-2酶肺炎克雷伯菌的体外抗菌效果。方法回顾性分析浙江省金华市第二医院2019年1月至2020年12月收治的150例产KPC-2酶肺炎克雷伯菌感染患者的临床资料,送检标本中共分离出产KPC-2酶的肺炎克雷伯菌150株,分析检出菌株的标本分布情况、药物敏感试验结果、KPC基因型筛查结果以及亚胺培南联合头孢他啶的最低抑菌浓度值。结果 150株产KPC-2酶肺炎克雷伯菌检出标本来源为痰液84株(56.0%)、尿液43株(28.7%)、分泌物11株(7.3%)、血液9株(6.0%)、腹腔积液3株(2.0%);菌株对亚胺培南的耐药率为48.7%(73/150),对头孢他啶的耐药率为100%(150/150),对二者联合的耐药率为22.7%(34/150);均为携带blaKPC-2基因型。亚胺培南与头孢他啶联合的分级抑菌浓度指数<0.5,两种药物存在协同作用。结论亚胺培南联合头孢他啶对产KPC-2酶肺炎克雷伯菌具有明显的体外抗菌效应,为临床治疗产KPC-2酶肺炎克雷伯菌感染增加了一种用药选择。

新型抗KPC-2型碳青霉烯酶纳米抗体的筛选与鉴定

目的:产KPC-2型肺炎克雷伯菌可引起β-内酰胺类抗生素、碳青霉烯类抗生素产生耐药性。通过噬菌体展示技术从抗KPC-2纳米抗体文库中筛选与KPC-2特异性结合的纳米抗体,为产KPC-2型肺炎克雷伯菌耐药性的检测和诊断提供技术支持。方法:利用重组KPC-2免疫双峰骆驼,从骆驼的外周血淋巴细胞中提取RNA,逆转录为cDNA,通过两轮嵌套式PCR扩增出纳米抗体片段,构建抗体文库,并通过噬菌体展示技术筛选特异性纳米抗体。通过HPLC和OCTET分别进行表位分析和亲和力测定。结果:构建了一个库容为5.47×10^(8)cfu/ml且插入有效片段不低于81.25%的纳米抗体文库;并建立抗KPC-2纳米抗体的免疫淘选方法;获得了2个不同CDR3区的纳米抗体K2和K5,亲和力分别为6.0 nmol/L和4.8 nmol/L。且在KPC-2上具有2个非竞争性结合表位。结论:成功淘选出2个不同表位的特异性纳米抗体,有望替代传统抗体用于肺炎克雷伯菌耐药性疾病的检测和诊断。

常用抗菌药物对产KPC-2酶肺炎克雷伯菌的体外抗菌效应研究

目的探讨常用抗菌药物对产青霉烯-2(KPC-2)酶肺炎克雷伯菌的体外抗菌效应研究,为肺炎克雷伯菌临床治疗提供参考。方法收集2012年1月-2015年12月确诊肺炎克雷伯菌感染患者标本中分离20株产KPC-2酶肺炎克雷伯菌,测定菌株对头孢吡肟(FEP)、头孢西丁(FOX)、阿莫西林/克拉维酸(AMC)、头孢他啶(CAZ)、亚胺培南(IPM)、美洛培南(MEM)、环丙沙星(CIP)及米诺环素(MI)的最低抑菌浓度(MIC),分析FEP+CIP、FEP+AMC、IPM+MI、IPM+CIP、CAZ+AMC联合作用(PIC指数)。结果 20株产KPC-2酶肺炎克雷伯菌对AMC、CAZ完全耐药,耐药率为100.00%,对FOX、CIP耐药率为75.00%,对FEP、IPM、MEM耐药率分别为30.00%、25.00%、30.00%,对MI完全敏感,耐药率为0.00%;FEP+CIP时2株出现协同、12株出现相加、40株出现无关、2株出现拮抗,构成比分别为10.00%、60.00%、20.00%、10.00%,FEP+AMC时17株出现协同、2株出现相加、1株出现拮抗,构成比分别为85.00%、10.00%、5.00%,IPM+MI时10株出现相加、4株出现无关、6株出现拮抗,构成比分别为50.00%、20.00%、30.00%,IPM+CIP时2株出现协同、8株出现相加、7株出现无关、3株出现拮抗,构成比分别为10.00%、40.00%、35.00%、15.00%,CAZ+AMC时12株出现协同、6株出现相加、2株出现拮抗,构成比分别为60.00%、30.00%、10.00%;对FEP+CIP、FEP+AMC、IPM+MI、IPM+CIP、CAZ+AMC的耐药率分别为20.00%、20.00%、90.00%、50.00%、80.00%。结论产KPC-2酶肺炎克雷伯菌对MI敏感,对AMC、CAZ完全耐药,FEP+AMC、CAZ+AMC在体外效应以协同作用为主,其机制值得进一步研究。

产KPC-2酶肺炎克雷伯菌毒力、血清型及基因分型研究

目的探讨产KPC-2酶肺炎克雷伯菌毒力、血清型及基因分型,为临床诊治肺炎克雷伯菌感染提供参考依据。方法收集2015年1月-2016年1月在医院住院243例患者各种标本中培养分离出肺炎克雷伯菌菌株147株,采用PCR扩增技术对allS、rmpA、kfuBC、mrkD、cf29a、uge、fimH、wabG、ureA等9种毒力基因及K1、K2、K5、K20、K54、K57等6种血清型进行检测,分析结果。结果 52株碳青霉烯类敏感,均不产KPC-2酶,95株耐药,均产KPC-2酶,构成比为35.37%、64.63%;不产KPC-2酶的菌株allS基因阳性率高于产KPC-2酶菌株(P<0.05)。结论产KPC-2酶肺炎克雷伯菌毒力allS基因较不产KPC-2酶肺炎克雷伯菌下降,血清型与不产KPC-2酶肺炎克雷伯菌无明显差异。

广东省东莞地区发现1株泛耐药产KPC-2型碳青霉烯酶的肺炎克雷伯菌

目的研究泛耐药肺炎克雷伯菌的相关耐药机制和治疗对策。方法细菌鉴定采用VITEK2全自动细菌鉴定系统,药敏试验采用K-B法,通过产碳青霉烯酶确证试验(改良Hodge试验)及聚合酶链反应(PCR)检测KPC-2基因,并进行序列测定。同时调查感染患者的诊疗情况。结果常规药敏试验显示,该菌株对阿米卡星敏感,对其他抗菌药物均耐药;Hodge试验阳性,PCR检测到KPC-2基因,序列测定与GenBank 11844849序列一致。患者经拔除气管插管,入住隔离病房,加强支持治疗后,1个月内未检测到泛耐药肺炎克雷伯菌。结论加强泛耐药肺炎克雷伯菌监测,提高对泛耐药菌的认识有助于感染疾病的治疗和预防。

高毒力肺炎克雷伯菌中KPC-2型碳青霉烯酶对细菌毒力的影响

目的了解高毒力肺炎克雷伯菌获得KPC-2型碳青霉烯酶后对细菌毒力的影响。方法收集3株碳青霉烯类敏感的高毒力肺炎克雷伯菌野生株(hvKP)作为实验菌株并调查其临床信息,采用PCR方法检测其毒力基因、荚膜血清分型及ST分型等。采用过表达实验将blaKPC-2克隆至pHSG396质粒并转化至hvKP野生株构建blaKPC-2转化株,采用血清抵抗试验和生物膜实验比较hvKP野生株和blaKPC-2转化株对血清中杀菌物质的抵抗能力及生物被膜形成能力,低速度离心沉降实验及糖醛酸测定比较二者黏液性及荚膜多糖含量,荧光定量PCR检测荚膜多糖结构基因及调控基因转录水平表达情况。结果3株hvKP野生株中1株为ST23 K1型,所检测的10种毒力基因均为阳性。另外2株均为ST65 K2型,毒力基因rmpA、rmpA2、iroB、iutA、ybtS、entB、mrkD均为阳性,magA、allS及kfu均为阴性。与hvKP野生株相比,blaKPC-2转化株对血清中杀菌物质的抵抗能力明显下降,生物被膜形成能力明显下降,细菌黏液性下降,荚膜多糖含量下降,荚膜多糖结构基因及调控基因转录水平下降。结论hvKP野生株获得KPC-2型碳青霉烯酶后可导致细菌荚膜多糖产生减少,可能导致细菌毒力降低。

KPC-2型碳青霉烯酶的表达纯化及其催化抗生素水解的动力学

目的:表达纯化KPC-2型碳青霉烯酶,并研究其催化抗生素水解的酶动力学活性。方法:将KPC-2基因与pET-22b(+)原核表达载体连接后转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,表达产物经FF镍柱纯化后,SDS-PAGE检测蛋白的纯度;用BioTek酶联仪进一步检测其抗生素水解范围及动力学特性。结果:构建了高效表达KPC-2的工程菌,得到了纯度在90%以上的KPC-2蛋白,该蛋白能水解几乎所有β内酰胺类抗生素,其水解美罗培南等碳青霉烯类抗生素的能力较强,最适温度约为40℃,最适pH值约为6.5。结论:为进一步了解最常见的KPC功能与活性提供了重要信息。

一株产KPC-2型碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌耐药机制的研究

目的研究一株多重耐药肺炎克雷伯菌的耐药机制。方法采用微量肉汤稀释法测定该菌株对亚胺培南、美罗培南等18种临床常用药物的最低抑菌浓度(MIC)。通过质粒提取、聚合酶链反应(PCR)扩增和耐药基因克隆测序分析该菌株耐药机理。结果该菌对所测临床常用药物均耐药,对美罗培南和亚胺培南的MIC值均为256μg/ml,美罗培南/克拉维酸和亚胺培南/克拉维酸的MIC值分别为256μg/ml和128μg/ml。PCR产物电泳示扩增条带大小为1050bp左右,与预计相符,经测序和在线比对,证实为KPC-2型编码基因。结合药敏结果,不排除该菌还存在其他耐药机理。结论该菌株质粒上携带KPC-2编码基因,临床抗生素运用须谨慎,医院感染防护需加强。

KPC-2及IMP-4酶介导肠杆菌科细菌碳青霉烯类耐药研究

目的探讨我院肠杆菌科细菌对碳青霉烯类抗生素的耐药机制及其流行特点。方法收集杭州市富阳区第一人民医院2013年1月至2014年8月分离的对碳青霉烯类抗生素（厄他培南）敏感性下降的肠杆菌科细菌，采用K-B纸片法及E-test法进行药敏试验，改良Hodge试验、EDTA抑制试验及超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）表型筛选试验进行耐药表型筛选；采用PCR法及测序技术检测耐药基因、KPC基因周围序列和肺炎克雷伯菌7个管家基因，多位点序列分型进行7个管家基因的序列分析；运用PFGE对鉴定为同一菌种的细菌进行同源性分析；采用S1-PFGE联合Southern杂交对已明确的碳青霉烯耐药基因进行基因定位。结果共收集到19株厄他培南敏感性下降的肠杆菌科细菌，所有菌株呈多重耐药现象，且同一菌株常携带有多种耐药基因，其中blaKPC-2、blaIMP-4、blaSHV-1、blaCTX-M-65、blaCTX-M-15、blaTEM-1、rmtB为最常见共同携带的耐药基因。PFGE结果提示14株肺炎克雷伯菌呈多克隆分布，MLST分型以ST11型为主。11株肺炎克雷伯菌和1株大肠埃希菌产KPC-2酶，blaKPC-2基因分别定位于4种大小不同的质粒上（大小分别约为95kb、140kb、200kb及240kb），所有菌株blaKPC-2。周围基因结构从上游至下游均为ISKpn8、blaKPC-2和ISKpn6-like元件；1株产酸克雷伯菌和1株肺炎克雷伯菌产IMP-4型碳青霉烯酶，blaIMP-4。基因定位于大小约为300kb的质粒上。结论KPC-2型及IMP-4型碳青霉烯酶是造成我院肠杆菌科细菌对碳青霉烯类抗生素耐药的主要原因；我院碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌（CRKP）菌株呈多克隆散在播散的流行特点，未发现优势克隆。

浙江省丽水地区发现1株泛耐药产KPC-2碳青霉烯酶的肺炎克雷伯菌

目的研究泛耐药肺炎克雷伯菌的相关耐药机制及初步探讨治疗对策。方法细菌鉴定采用Vitek-compact细菌鉴定系统,药敏实验采用K-B法,通过产碳青霉烯酶确证试验(Hodge实验)及聚合酶链反应(PCR)检测KPC-2基因,并进行序列测定。同时调查患者感染的诊疗情况。结果常规药敏实验显示除多粘菌素、米诺环素外全部耐药;增加磷霉素K-B法药敏实验显示抑菌环直径为20mm,K-B法协同药敏实验显示多粘菌素、米诺环素、磷霉素、亚胺培南等均无协同抗菌活性;Hodge实验阳性,PCR检测到KPC-2基因,序列与GenBank AF297554序列一致。患者经拔除导尿管,入隔离病房,加强支持治疗后,1个月内未检查到泛耐药肺炎克雷伯菌。结论加强泛耐药肺炎克雷伯菌监测,提高对泛耐药菌的认识有助于感染疾病的治疗和预防。

质粒介导的KPC-2型碳青霉烯酶水平传播机制的探讨

目的了解河南省人民医院耐美罗培南肺炎克雷伯菌和日勾维肠杆菌是否携带KPC型碳青霉烯酶基因,探讨blaKPC基因的水平传播机制。方法采用琼脂稀释法进行药物敏感性试验,PCR检测KPC编码基因,质粒电转化试验分析blaKPC基因能否水平传播,质粒酶切电泳图谱判断质粒的相似性。结果两株耐美罗培南肺炎克雷伯菌和日勾维肠杆菌均检测出KPC型碳青霉烯酶基因,测序比对结果显示为KPC-2型碳青霉烯酶,其编码基因blaKPC-2位于质粒上,并且可以在细菌之间进行水平传播。结论质粒介导的KPC-2型碳青霉烯酶是我院肠杆菌科细菌耐药性水平传播的机制之一。

产KPC-2型碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌耐药致泌尿系感染机制分析

目的:研究宁乡市人民医院产KPC-2型碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌致泌尿系感染的潜在机制。方法:对产KPC-2型碳青霉烯酶的病例进行筛选入组,分离菌株后,利用聚合酶链反应(PCR)对其进行荚膜血清型基因及毒力基因的检测,采用体外验证的方式确定菌株在小鼠体内的高毒力性。结果:收集2018年4月~2019年4月宁乡市人民医院CRKP致泌尿系感染的病例35名,其中12株产KPC-2酶,毒力荚膜血清型检出3例,分别为K2型2例,K1型1例,K1携带2种毒力基因:rmpA、magA(K1),K2携带3种毒力基因:magA(K1)、rmpA、mrkD。据产KPC-2酶肺炎克雷伯菌感染的小鼠死亡率结果,与未检出毒力基因的CRKP对比,注入K1及K2型菌株的小鼠死亡率于第7天死亡率更高,且K2型菌株较K1型菌株感染致小鼠死亡更快。结论:宁乡市人民医院产KPC-2碳青霉烯酶的CRKP可能在携带更多毒力基因从而造成更强毒力的高毒力荚膜血清型如K1、K2型中产生。

siHybrids对耐碳青霉烯类抗生素肺炎克雷伯菌kpc-2基因表达水平的影响

目的研究si Hybrids对耐碳青霉烯类抗生素肺炎克雷伯菌kpc-2基因表达水平及其对美罗培南的抑菌效果的影响,探讨si Hybrids的作用机制。方法将48株携带有kpc-2基因的耐碳青霉烯类抗生素肺炎克雷伯菌株分成对照组(不加si Hybrid)、低浓度组(si Hybrids为0.125μg/ml)、高浓度组(si Hybrids为8.0μg/ml)。分别检测3组12、24、48 h后3个时间点的mRNA的量。另外再分别取3组菌液进行美罗培南药敏试验,观察3组间抑菌圈直径的大小有无差异。结果与对照组相比较,si Hybrids干预后kpc-2基因的mRNA表达量显著下降(P<0.05),高浓度组kpc-2基因的mRNA表达量显著低于低浓度组(P<0.05),si Hybrids的浓度与kpc-2基因的mRNA表达量呈负相关(r=-0.782,P=0.014);kpc-2基因的mRNA表达量随着si Hybrids干预时间的延长而显著下降(P<0.05)。si Hybrids干预能显著增大美罗培南抑菌圈的直径(P<0.05),不同浓度的si Hybrids对美罗培南抑菌圈直径的增大幅度不同,高浓度组美罗培南抑菌圈的直径显著大于低浓度组(P<0.05),si Hybrids的浓度与美罗培南抑菌圈直径的大小呈正相关(r=0.882,P=0.024)。结论 si Hybrids能降低耐碳青霉烯类抗生素肺炎克雷伯菌kpc-2基因的表达水平,能提高美罗培南的抑菌效果,其作用机制是si Hybrids分子特异性沉默了肺炎克雷伯菌的kpc-2基因。

血流感染肺炎克雷伯菌对碳青霉烯类抗菌药物耐药机制研究

目的了解临床血流感染肺炎克雷伯菌对碳青霉烯类抗菌药物的耐药机制,为其治疗提供实验依据。方法收集浙江省人民医院2016年1月-12月门诊及住院患者血流感染肺炎克雷伯菌72株,应用法国梅里埃VITEK 2 Compact检测肺炎克雷伯菌药物敏感性;应用PCR法检测相关碳青霉烯酶耐药基因(blaKPC、blaNDM、blaVIM、blaIMI、blaIMP和blaOXA-48),应用MLST方法检测菌株克隆型别。结果 2016年1月-12月门诊及住院患者血流感染肺炎克雷伯菌72株,其中碳青霉烯敏感肺炎克雷伯菌(CSKP) 48株,占66.7%,碳青霉烯耐药肺炎克雷伯菌(CRKP) 24株,占33.3%;肺炎克雷伯菌对常用抗菌药物敏感性均较低,特别是β-内酰胺类抗菌药物。替加环素体外显示出极高敏感性,仅4.2%菌株耐药;24株菌株全部检出blaKPC-2基因,其他耐药基因未检出。结论本院血流感染肺炎克雷伯菌对碳青霉烯类抗菌药物的耐药机制主要是产KPC-2酶。碳青霉烯耐药肺炎克雷伯菌在本院呈克隆播散趋势,应引起临床高度重视。

碳青霉烯类耐药弗劳地枸橼酸杆菌耐药及毒力基因的分析

目的对临床分离的碳青霉烯类耐药弗劳地枸橼酸杆菌(carbapenem resistant Citrobacter freundii,CRCF)进行耐药及毒力基因分析,为控制CRCF感染提供依据。方法收集昆明医科大学第一附属医院2016年1月至2017年12月22株CRCF,通过VITEK2 Compact系统对菌株进行细菌鉴定及药敏试验,用PCR检测菌株耐药及毒力基因的携带情况。结果药敏结果显示,菌株对青霉素类、头孢菌素类及碳青霉烯类抗生素的耐药率均为100%,对氨曲南、环丙沙星、左氧氟沙星、庆大霉素、四环素、复方新诺明及呋喃妥英等抗生素呈现出不同程度的耐药;22株菌株耐药基因检测结果显示,KPC-2、IMP、NDM-1、TEM、SHV和CTX等阳性率分别为27%、32%、82%、82%、23%和27%,携带2种或以上耐药基因的阳性率为91%;18株菌株毒力基因检测结果显示,ureA、wabG、ycf和uge等阳性率依次为41%、23%、14%和14%,未检测到IroN、allS、KfuB、iutA、ybtS、VatD及fimH等毒力基因。结论该院CRCF碳青霉烯类耐药性主要由NDM-1基因介导,而其毒力主要与脂多糖相关,多重耐药毒力强的CRCF应引起临床高度重视。