基于KRAS蛋白结构的药学研究——生物化学课程教育教学改革研究与实践

目的:本项目通过将生物化学领域里的结构生物学知识应用于药学研究,拓展了基于结构的药物分子分析与设计的理论与技术。通过对药物靶点蛋白结构的统计与分析,研究了KRAS相关蛋白质结构与功能之间的关系,以及药物分子靶向目标蛋白质的分子机制,完成其结构与功能之间关系的分析,指导化合物的合成,为新药设计奠定基础。方法:主要通过PDB、PDBePISA、UniProt等数据库和网络服务器以及Chem3D、UCSF Chimera、PyMol、Origin等软件对于KRAS相关蛋白质的一系列重要参数进行检索、计算和绘图等,收集、整理、分析KRAS蛋白质分子的结构域功能信息,研究药物分子靶向目标蛋白质的分子机制。结果:KRAS蛋白与其配体化合物的结合面积与化合物的分子量呈正相关(除少部分外)。此外,KRAS蛋白与其配体化合物的结合为非共价结合时,化合物的摩尔折射率和分配系数都对其理论结合能影响不大,几乎维持在−5 kcal/mol到5 kcal/mol之间,而且配体化合物通常结合在Switch-II Pocket (S-IIP)附近。而当KRAS蛋白与其配体化合物的结合为共价结合时,突变体的结合能几乎都为负值,绝对值显著增大,而非突变体的结合能变化不大,依旧维持在−5 kcal/mol到5 kcal/mol之间,且配体化合物往往结合于第12位的甘氨酸突变产生的半胱氨酸附近。结论:靶向KRAS的药物分子若能够与蛋白质中由第12位的甘氨酸突变产生的半胱氨酸形成共价结合,且分子量较大,则其与蛋白质的结合面积相对较大、结合较为牢固、特异性更强,或者药物分子可以以非共价结合的方式结合于S-IIP附近,可以增强对KRAS的抑制效应。

MicroRNA143调节结肠癌细胞KRAS蛋白的表达

目的:探讨结肠癌细胞中microRNA143(miR-143)对KRAS蛋白表达的影响及其作用机制。方法:从基因组DNA中克隆pri-miR-143基因,构建miR-143的表达载体。miR-143转染结肠癌细胞系SW480,用Northern blotting方法测定miR-143水平的变化,通过RT-PCR和Western blotting方法检测转染细胞中KRAS基因的表达。构建含miR-143结合位点的荧光素酶报告载体,与miR-143表达载体共转染,检测细胞中的荧光素酶活性。结果:基因转染的SW480细胞中miR-143的表达显著升高,KRAS蛋白的表达水平下降约40%,KRAS mRNA则未受影响。miR-143表达载体与含miR-143结合位点的报告载体共转染可以抑制细胞中的荧光素酶活性。结论:结肠癌细胞中microRNA143在转录后水平抑制KRAS蛋白的表达。

结肠癌KRAS蛋白磷酸化与化疗抵抗的相关性研究

目的 :结肠癌是最常见的恶性肿瘤,表皮生长因子受体是结肠癌治疗的靶点。然而耐药性一直是治疗结肠癌的难点。为了减少耐药事件的发生,针对个体化的基因检测将为解决耐药性提供新方案。方法 :收集52例晚期结肠癌临床标本和资料,免疫染色检测了5-FU治疗对抗和不对抗患者中,磷酸化KRAS表达情况。结果 :在5-FU治疗对抗组,磷酸化KRAS表达明显高于正常对照组和不对抗组,具有统计学差异。结论 :磷酸化KRAS表达情况将为晚期结肠癌个体化化疗提供参考。

p53、KRAS、APC蛋白及Ki-67在溃疡性结肠炎2种中医证型患者中的表达特点

目的探讨脾胃气虚证和湿热内蕴证溃疡性结肠炎(UC)患者肠黏膜活检组织中p53、KRAS、APC蛋白及增殖指数Ki-67的表达特点和意义。方法根据中医辨证分型及有无异型增生将64例UC患者分为脾胃气虚证组23例,湿热内蕴证组22例,脾胃气虚证伴低级别异型增生组9例,湿热内蕴证伴低级别异型增生组10例。选取同期肠镜活检组织呈轻度慢性炎者10例作为正常组,大肠癌患者11例作为大肠癌组。采用免疫组织化学方法检测各组患者肠黏膜组织内p53、KRAS、APC蛋白及Ki-67表达情况。结果UC各组患者肠黏膜组织内p53蛋白表达阳性和Ki-67位于隐窝上1/2者的比例均明显低于大肠癌组(P均<0.05);脾胃气虚证组和湿热内蕴证组p53蛋白表达阳性和Ki-67位于隐窝上1/2者的比例基本相同;脾胃气虚证伴低级别异型增生组p53蛋白表达阳性和Ki-67位于隐窝上1/2者的比例高于湿热内蕴证伴低级别异型增生组,但差异无统计学意义;UC各组患者肠黏膜组织内均未见KRAS蛋白和APC蛋白表达。结论脾胃气虚证伴低级别异型增生患者存在更高比例的肠黏膜上皮p53蛋白过表达及黏膜上皮增生活跃、缺乏成熟现象等癌变危险因素,对于脾胃气虚证伴低级别异型增生患者应加强随访和肠镜监测。

KRAS4A^(G12C)和KRAS4B^(G12C)对人肺上皮细胞生长和运动的作用差异及机制研究

目的·探究含有致癌突变KRAS^(G12C)的2种剪接体KRAS4A^(G12C)和KRAS4B^(G12C)促进人正常肺支气管上皮细胞生长和运动的差异,并初步探讨其分子机制。方法·在人正常肺支气管上皮细胞BEAS-2B中通过慢病毒包装和感染构建KRAS4A^(G12C)和KRAS4B^(G12C)稳定过表达细胞株,蛋白质印迹法(Western blotting)检测模型是否构建成功,倒置相差显微镜观察细胞形态,实时动态细胞成像分析系统观察细胞增殖变化,细胞划痕及细胞迁移实验观察细胞运动的变化。机制探究上,使用RNA高通量测序方法(RNA-seq)对细胞全转录组水平进行测序,对测序结果进行京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)通路富集分析及基因集富集分析(Gene Set Enrichment Analysis,GSEA),寻找差异基因及信号通路变化,实时荧光定量PCR进一步验证。2组间比较采用student's t检验,P<0.05时认为差异具有统计学意义。结果·KRAS4A^(G12C)和KRAS4B^(G12C)过表达均引起BEAS-2B细胞形态变化,有伪足状结构和细胞连接增加;BEAS-2B KRAS4B^(G12C)细胞和BEAS-2B KRAS4A^(G12C)细胞增殖能力均显著强于亲本BEAS-2B细胞;细胞划痕实验结果表明BEAS-2B KRAS4B^(G12C)细胞伤痕愈合能力显著强于BEAS-2B KRAS4A^(G12C)细胞(P=0.006),且显著强于BEAS-2B亲本细胞(P=0.000);Transwell实验结果表明BEAS-2B KRAS4B^(G12C)细胞迁移能力显著强于BEAS-2B KRAS4A^(G12C)细胞(P=0.048),且显著强于BEAS-2B亲本细胞(P=0.033);与BEAS-2B KRAS4A^(G12C)细胞相比,BEAS-2B KRAS4B^(G12C)细胞中细胞黏附分子相关信号通路显著上调(P=0.002);BEAS-2B KRAS4B^(G12C)细胞紧密连接蛋白1(claudin 1,CLDN1)的mRNA水平显著高于BEAS-2B KRAS4A^(G12C)细胞(P=0.000);BEAS-2B KRAS4B^(G12C)细胞黏附分子3(cell adhesion molecule 3,CADM3)的mRNA水平显著高于BEAS-2B KRAS4A^(G12C)细胞(P=0.000)。结论·该文首次报道了含有致癌突变KRAS^(G12C)的2种剪接体KRAS4A^(G12C)和KRAS4B^(G12C)促进BEAS-2B细胞生长和运动能力的差异以及潜在的分子机制,即KRAS4A^(G12C)和KRAS4B^(G12C)均可促进人肺支气管上皮细胞BEAS-2B增殖,而且KRAS4B^(G12C)促进肺上皮细胞BEAS-2B运动能力更强,可能与黏附相关基因CLDN1和CADM3表达水平更高相关,为KRAS特异性靶向抑制剂的研究提供了实验依据和理论基础。

赤凤迎源针刺法对面神经损伤模型大鼠Ras/MEK/ERK信号通路的影响

目的探讨赤凤迎源针刺法对面神经超微结构、丝裂原活化的细胞外信号调节激酶(mitogen-activated extracellular signal-regulated kinase,MEK)、细胞外信号调节蛋白激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK)及血清KRas蛋白表达的影响。方法将SD大鼠随机分为空白对照组、模型组、常规针刺组、赤凤迎源针刺组,每组8只。除空白对照组大鼠正常饲养外,其他各组大鼠用面神经颊支压榨法诱导面神经损伤模型。造模成功后,予以干预2周。干预结束后,行电镜检查观察大鼠的面神经超微结构;通过HE染色观察面神经组织形态组织学变化;ELISA法检测血清KRas的表达水平;Western blot检测面神经组织MEK、ERK蛋白的表达水平。结果造模后,与空白对照组比较,另外3组大鼠动物行为学评分均明显升高(P<0.01)。针刺2周后,常规针刺组及赤凤迎源针刺组大鼠评分明显低于模型组(P<0.01),且赤凤迎源针刺组评分低于常规针刺组(P<0.01)。针刺2周后,与模型组对比,常规针刺组及赤凤迎源针刺组面神经轴突纤维排列较紧密,内质网较多,KRas蛋白表达明显升高(P<0.05),面神经MEK蛋白、ERK蛋白表达升高(P<0.05),且赤凤迎源针刺组均高于常规针刺组(P<0.05)。结论赤凤迎源针刺法可改善面神经损伤模型大鼠动物行为学,上调KRas、MEK及ERK表达水平,可能与激活Ras/MEK/ERK信号通路有关,从而修复面神经损伤。

胃癌微卫星不稳定和KRAS基因突变与肿瘤免疫微环境的关系

目的检测胃癌患者微卫星不稳定(MSI)和KRAS基因突变状态,探讨两者相互关系及对肿瘤免疫微环境的影响。方法收集胃癌90例,采用多重荧光PCR法检测MSI,ARMS-PCR法检测KRAS基因第2号外显子突变,通过流式细胞分析术检测部分胃癌术后标本TILs CD8和PD-1表达水平。结果 MSI在胃癌中总发生率43.3%,KRAS基因突变率为8.89%,两者均在性别、年龄、肿瘤分期方面差异无统计学意义(P>0.05),两者之间不存在明显相关性(r=-0.037)。在不同MSI状态或KRAS基因突变背景下,胃癌组织TILs中CD8表达水平差异均无统计学意义(P>0.05)。KRAS基因突变与PD-1表达水平无明显相关性(P>0.05)。MSI-H组PD-1表达水平显著高于MSI-L组和MSS组(P<0.01)。结论 MSI发生和KRAS基因突变是胃癌形成过程中的相对独立事件,MSI-H表达的胃癌患者可能受益于肿瘤免疫治疗。

KRAS相关信号通路与小分子抑制剂研究进展

KRAS基因属于Ras基因家族,其编码的KRAS蛋白通过激活下游信号通路参与细胞增殖、分化及凋亡等生命活动的调控。某些KRAS基因突变会引起KRAS蛋白过度表达和持续活化,进而过度激活下游信号通路,导致细胞不可控制地增殖恶变,最终造成组织癌变。寻找KRAS突变相关肿瘤的治疗策略一直是研究热点之一,然而KRAS蛋白突变体是公认的难靶蛋白之一,其直接作用靶点的小分子抑制剂的设计具有很大的挑战性,目前尚无相关药物批准上市。通过对KRAS蛋白结构与功能、相关信号通路和突变体在肿瘤发生发展中的作用,以及相关小分子抑制剂的突破性研究进展进行综述,为进一步研发KRAS突变肿瘤治疗药物提供参考。