GSK525762A对KU812细胞增殖与凋亡的影响及其作用机制

本研究旨在观察4型含Bromo结构域蛋白(bromodomain-containing protein 4,BRD4)抑制剂GSK52-5762A对KU812细胞增殖及凋亡的影响及其机制。用GSK525762A 100、250、500、1000、2500和5000 nmol/L处理KU812细胞48和72 h,CCK-8法检测其对细胞增殖的影响;GSK525762A 1.0、2.5和5.0μmol/L处理72 h,利用流式细胞术检测其对KU812细胞的凋亡诱导作用。将KU812细胞经DMSO和2.5μmol/L的GSK525762A处理后,利用实时荧光定量PCR观察c-Myc、BCL-2、CDK6、BCL-xL、BAK和BAX基因的mRNA表达水平。结果表明,GSK525762A能显著抑制KU812细胞的增殖,且抑制作用存在量-效关系(r=0.970)和时-效关系(r=0.956);GSK525762A能促进KU812细胞的凋亡;GSK525762A处理后促增殖基因c-Myc、CDK6和抗凋亡基因BCL-2和BCL-xL的mRNA较对照组降低,而促凋亡基因BAK和BAX的转录水平较对照组升高。结论:GSK525762A显著抑制KU812细胞的增殖并促进其凋亡,其机制可能与下调c-Myc、BCL-2、CDK6、BCL-xL的表达和上调BAK、BAX的表达有关。

黄曲霉毒素B_(1)对卵白蛋白激发人外周血嗜碱性白血病细胞(KU812)脱颗粒的影响

目的 研究黄曲霉毒素B_(1)(aflatoxin B_(1), AFB_(1))暴露对鸡蛋过敏原卵白蛋白(ovalbumin, OVA)激发人外周血嗜碱性白血病细胞(KU812)脱颗粒的影响,以阐明AFB_(1)暴露与食物过敏的相关性。方法 构建AFB_(1)暴露下OVA激发KU812细胞脱颗粒模型,采用酶联免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)检测AFB_(1)对其生物活性介质β-氨基己糖苷酶(β-hexosaminidase,β-HEX)和组胺,以及细胞因子白细胞介素-4(interleukin-4, IL-4)、白细胞介素-6 (interleukin-6, IL-6)、白细胞介素-1β (interleukin-1β, IL-1β)释放量的影响;然后采用实时定量荧光聚合酶链反应法分析对IL-4和IL-6的mRNA表达水平的影响。结果 OVA刺激KU812细胞后会使其释放更多生物活性介质,包括β-HEX、组胺及细胞因子(IL-4、IL-6、IL-1β);当有AFB_(1)同时暴露,则会不同程度地加重这些生物活性介质的释放量。其中,AFB_(1)对β-HEX和组胺的释放量影响较小;但能够显著提高细胞因子IL-4、IL-6以及IL-1β的分泌量(P<0.01),尤其是对IL-1β的影响更显著,相较于对照组其分泌量提高84%。同时IL-4和IL-6的mRNA基因的表达水平也被提高。结论 OVA激发KU812会导致其脱颗粒并释放与食物过敏相关的一些活性介质和细胞因子。而AFB_(1)质量浓度为10000ng/mL的同时暴露,会提高这些相关活性介质和细胞因子的释放量,从而加重OVA所引发的食物过敏反应。

高盐刺激嗜碱性粒细胞产生促炎因子及其分子机制

本研究以食物过敏重要的效应细胞嗜碱性粒细胞(KU812)为对象,探究高盐条件对嗜碱性粒细胞脱颗粒以及相关细胞因子表达的影响,并初步探讨其分子机制。首先利用酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)和实时荧光定量聚合酶链式反应(real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction,qPCR)分析高盐条件下KU812细胞脱颗粒释放生物活性介质和促炎细胞因子的变化;并用q PCR分析血清和糖皮质激素调节蛋白激酶1(serum and glucocorticoid-regulated kinase 1,SGK1)抑制剂和P38抑制剂对高盐条件下KU812细胞产生白细胞介素(interleukin,IL)-4的影响。结果表明,高盐条件并不能促进KU812细胞脱颗粒释放生物活性介质组胺和β-氨基己糖苷酶,但能促进其产生促炎因子IL-6和肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)-α;高盐条件也可以促进KU812细胞产生IL-4,同时伴随着SGK1基因的高表达,并且使用SGK1抑制剂和P38抑制剂都可以显著抑制高盐条件下KU812细胞表达SGK1和IL-4。综上,高盐条件会通过P38-SGK1信号通路促进KU812细胞产生IL-4。

糖基化联合磷酸化降低鲢鱼小清蛋白致敏性的机制

以鲢鱼小清蛋白(parvalbumin,PV)为研究对象,采用糖基化联合磷酸化对其进行修饰,运用光谱、质谱和KU812细胞实验等方法研究修饰后鲢鱼PV抗原表位和致敏性的变化。结果表明:糖基化联合磷酸化修饰可增加鲢鱼PV分子质量,降低游离氨基含量,且改变其二级结构和构象结构;糖基化联合磷酸化修饰后的鲢鱼PV含有8个糖基化位点(K33、K46、K55、K65、K84、K88、K97和K108)和1个磷酸化位点(S56)。糖基化联合磷酸化修饰能显著降低鲢鱼PV与IgG/IgE的结合能力,也能降低KU812细胞中组胺和白介素-6的释放能力。因此,糖基化联合磷酸化修饰通过糖基化和磷酸化位点遮掩鲢鱼PV的线性表位和破坏其构象表位,降低其致敏性。研究结果为开发低致敏性鱼类制品提供重要的理论依据。

类过敏反应体外评价模型的建立及其指标的筛选

目的:以C48/80为阳性药物,比较3种细胞系(RBL-2H3,P8l5和Ku812细胞)及其指标在评价药物类过敏中的敏感性;并采用聚山梨酯80对3种细胞模型评价类过敏反应的适用性进行考察。方法:以不同浓度的C48/80分别作用于3种细胞系30和60 min,测定β-氨基糖苷酶释放率、Annexin V阳性细胞率以及IL-4和TNF-α释放量。然后,用聚山梨酯80进行模型的适用性考察,同时对不同浓度的聚山梨酯80引起的类过敏反应进行评价。结果:C48/80可引起3种细胞系的β-氨基糖苷酶释放率、Annexin V阳性细胞率、IL-4释放量和TNF-α释放量呈剂量依赖性增加;除了RBL-2H3细胞,其他2个细胞系检测到的IL-4释放量非常少,且3种细胞系检测到的TNF-a量亦非常少;Annexin V阳性细胞率的增加程度较其他3项指标明显;在相同刺激条件下,P815和Ku812细胞的β-氨基糖苷酶释放率和Annexin V阳性细胞率的突增较RBL-2H3细胞发生时间早,突增效果更明显。聚山梨酯80的结果与C48/80给药时基本吻合。此外,还发现聚山梨酯80≥0.05 mg·m L^(-1)时,即存在引起类过敏反应的风险。结论:β-氨基己糖苷酶释放率和Annexin V阳性细胞率是评价类过敏反应的2种稳定、可靠、重复性好的检测指标;IL-4释放量和TNF-α释放量较适合作为辅助检测指标;Annexin V阳性率可较敏感地、较早地提示类过敏反应的发生。P815和Ku812细胞较RBL-2H3细胞更适合作为一种早期、稳定、敏感的肥大细胞脱颗粒体外检测模型,用于致类过敏反应药物的早期筛选。