川陈皮素对食管癌KYSE150细胞存活、侵袭和凋亡的影响及机制实验研究

目的:探究川陈皮素对食管癌KYSE150细胞存活、侵袭及凋亡的影响及可能的机制。方法:将培养至对数生长期的KYSE150细胞分为对照组(常规培养)、顺铂组(0.5μg/ml顺铂)、川陈皮素低(10μg/ml)、中(20μg/ml)、高(40μg/ml)浓度组。采用MTT法检测KYSE150细胞存活率。采用Transwell实验检测KYSE150细胞侵袭能力。采用流式细胞术检测KYSE150细胞凋亡率。采用荧光定量PCR法检测KYSE150细胞Ras同源基因家族成员A(RhoA)、Rho相关卷曲螺旋蛋白激酶1(ROCK1)、ROCK2 mRNA表达。采用Western bolt法检测KYSE150细胞RhoA、ROCK1、ROCK2蛋白表达。结果:与对照组比较,顺铂组及川陈皮素低、中、高浓度组KYSE150细胞存活率、侵袭数目以及RhoA、ROCK1、ROCK2 mRNA和蛋白表达水平降低,凋亡率升高(均P<0.05)。与顺铂组比较,川陈皮素低、中浓度组KYSE150细胞存活率、侵袭数目以及RhoA、ROCK1、ROCK2 mRNA和蛋白表达水平升高,凋亡率降低(均P<0.05)。川陈皮素高浓度组和顺铂组上述指标比较差异无统计学意义(均P>0.05)。川陈皮素低、中、高浓度组KYSE150细胞存活率、侵袭数目以及RhoA、ROCK1、ROCK2 mRNA和蛋白表达水平依次降低,凋亡率依次升高(均P<0.05)。结论:川陈皮素能够抑制KYSE150细胞的存活和侵袭,促进凋亡,其机制可能与抑制RhoA/ROCK信号通路有关。

具核梭杆菌感染对食管癌KYSE150细胞紫杉醇化疗抵抗的影响

目的:探讨具核梭杆菌(Fn)感染对食管癌细胞紫杉醇(PTX)化疗的影响及其机制。方法:将食管癌细胞KYSE150分为Fn未感染组及Fn感染组(12、24、48和72 h),通过CCK-8及Western blot检测各组细胞的PTX 24 h药物半数抑制浓度(IC_(50))及炎症小体NLRP3蛋白表达量。构建NLRP3敲降的食管癌细胞KYSE150-N,然后分为KYSE150组、KYSE150-N组、KYSE150+Fn组和KYSE150-N+Fn组4组。通过Western blot及流式细胞术检测各组细胞系中NLRP3、乙醛脱氢酶1(ALDH1)蛋白表达量及肿瘤干细胞(CSCs)百分比;通过平板克隆、成球实验及CCK-8检测各组细胞的体外增殖能力、克隆成球能力及PTX 24 h IC_(50)。将裸鼠分为上述4组,按分组接种细胞。成瘤后每3 d尾静脉注射一次PTX(10 mg/kg),共6次。对比各组裸鼠的成瘤能力和瘤体组织中NLRP3、ALDH1蛋白表达量及CSCs百分比。结果:与Fn未感染组相比,Fn感染组(12、24、48和72 h)KYSE150细胞的PTX 24 h IC_(50)及NLRP3蛋白表达量均增高(P均<0.05)。与KYSE150组相比,KYSE150+Fn组细胞的NLRP3及ALDH1蛋白表达量、CSCs百分比、体外增殖能力、克隆成球能力、PTX 24 h IC_(50)、裸鼠瘤体对PTX的抗性、瘤体内NLRP3与ALDH1蛋白表达量及CSCs百分比均增高(P均<0.05);而KYSE150-N组细胞上述指标均降低(P均<0.05)。与KYSE150+Fn组细胞相比,KYSE150-N+Fn组细胞上述指标均降低(P均<0.05)。结论:Fn可通过激活NLRP3诱导ALDH1高表达、富集CSCs,降低食管癌细胞对PTX的敏感性,促进其恶性增殖。

核桃青皮粗提物诱导KYSE150食管癌细胞周期阻滞及凋亡

目的:研究核桃青皮粗提物诱导KYSE150人食管癌细胞周期阻滞和凋亡的作用机制。方法:MTT方法检测核桃青皮粗提物对KYSE150细胞增殖的抑制效果,流式细胞仪检测核桃青皮粗提物对KYSE150细胞周期和细胞凋亡的影响,Western blot检测核桃青皮粗提物引起的细胞周期相关蛋白和凋亡相关蛋白的变化。结果:MTT结果显示,核桃青皮粗提物对KYSE150细胞的增殖抑制呈时间和浓度依赖性,当核桃青皮粗提物浓度为100μg/mL时,在24 h,48 h和72 h对KYSE150细胞的增殖抑制率分别为(43.69±1.02)%,(88.73±1.32)%和(93.06±2.34)%;流式细胞术结果表明,核桃青皮粗提物诱导KYSE150细胞周期阻滞和凋亡;Western blot结果表明,核桃青皮粗提物通过上调p53,phospho-p53(p-p53)蛋白的表达,下调cyclinD1蛋白的表达,诱导KYSE150细胞周期阻滞在G0/G1期。另一方面,核桃青皮粗提物通过上调Bax蛋白,下调Bcl-2和Caspase-3蛋白的表达,从而诱导细胞凋亡。当核桃青皮粗提物浓度为40μg/mL时,可上调p53,p-p53,Bax的表达量分别为对照组的(1.8±0.07),(23.6±0.12)和(1.5±0.02)倍,下调cyclinD1,Bcl-2和Caspase-3的表达量分别为对照组的(0.3±0.02),(0.03±0.005)和(0.1±0.01)倍。结论:核桃青皮粗提物可以引发KYSE150细胞周期阻滞在G0/G1期,并且可以通过线粒体途径诱导KYSE150细胞凋亡。

壁虎活性组分抑制人食管癌KYSE150细胞增殖及迁移

目的研究壁虎活性组分(GACs)对食管癌KYSE150细胞增殖、迁移能力的影响及其潜在的分子机制。方法用不同浓度GACs(0、0. 1、0. 15、0. 2、0. 25、0. 3、0. 35、0. 4、0. 45、0. 5 mg·m L^(-1))处理KYSE150细胞24、48、72 h,噻唑蓝比色法(MTT)检测细胞增殖,根据MTT结果,分为正常组,低、中、高3个质量浓度(GACs:0. 1,0. 15,0. 225 mg·m L^(-1))观察组。GACs作用于KYSE150细胞后,划痕实验观察其迁移能力的改变;免疫印迹法检测GACs对KYSE150细胞E-钙黏蛋白、波形蛋白表达的影响。结果 GACs处理KYSE150细胞24、48、72 h后,IC50值分别为0. 22、0. 18、0. 15 mg·m L^(-1); KYSE150细胞迁移能力减弱。GACs处理后的KYSE150细胞内E-钙黏蛋白表达上调,波形蛋白表达下调。结论 GACs可抑制KYSE150细胞增殖与迁移,其机制可能与E钙黏蛋白表达的上调,波形蛋白表达的下调有关。

核桃青皮提取物对食管癌细胞增殖的抑制作用及其分子机制的探讨

目的:观察核桃青皮提取物对人食管癌细胞增殖的抑制作用。方法:用MTT法分别测定核桃青皮粗提物和核桃青皮提取物没食子酸、乙酸乙酯、紫杉叶素、7-D-芹菜糖-儿茶酚对食管癌细胞EC9706和KYSE150的增殖抑制率,并用Western Blot检测不同药物处理后食管癌细胞中细胞周期相关蛋白CyclinD1的蛋白表达。结果:核桃青皮粗提物、没食子酸和乙酸乙酯能抑制食管癌细胞的增殖,其作用呈明显剂量依赖性,当药物浓度增加至80μg/mL时,对KYSE150的抑制率分别为82.75%、90.51%、88.36%,对EC9706的抑制率分别为85.54%、87.21%、85.17%。与对照组相比,3种药物均会显著抑制KYSE150和EC9706细胞中CyclinD1的表达。结论:核桃青皮提取物对食管癌细胞系的增殖有较强的抑制作用,其机制可能与引起细胞周期阻滞有关。

应用CRISPR/Cas9技术敲除NFE2L2对食管鳞癌KYSE150细胞增殖的影响

目的采用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建NFE2L2缺失的食管鳞癌KYSE150(KYSE150 NFE2L2-KO)细胞株,观察NFE2L2敲除对食管鳞癌KYSE150细胞增殖的影响。方法应用CRISPR/Cas9基因编辑技术,构建重组NFE2L2_KO_three_gRNA_Cas9表达载体,将表达载体经转化、扩增、质粒抽提、验证和测序。采用Lipofectamine 2000将重组NFE2L2_KO_three_gRNA_Cas9表达载体转入食管鳞癌KYSE150细胞,经Sanger测序验证转染效率后,培养并筛选单克隆细胞株,获得NFE2L2纯合缺失的食管鳞癌KYSE150单克隆细胞株,并通过Sanger测序、逆转录定量-聚合酶链反应(qRT-PCR)和蛋白印迹法实验验证。将NFE2L2缺失的KYSE150单克隆细胞株设为KYSE150 NFE2L2-KO组,KYSE150单克隆细胞株设为KYSE150组。采用细胞计数试剂法(CCK-8)和克隆形成实验观察NFE2L2敲除对食管鳞癌KYSE150细胞增殖的影响。结果Sanger测序验证结果表明NFE2L2_KO_three_gRNA_Cas9表达载体构建成功以及NFE2L2基因第二外显子上37 kb碱基纯合缺失KYSE150单克隆细胞株成功获得。KYSE150 NFE2L2-KO组,蛋白印迹法未检测到NFE2L2蛋白表达。KYSE150 NFE2L2-KO组中NFE2L2 mRNA表达水平为0.36±0.03,低于KYSE150组的1.04±0.12,t=10.660,P<0.001;CCK-8实验结果显示,48 h时KYSE150 NFE2L2-KO组的细胞增殖活力为4.38±0.31,低于KYSE150组的5.62±0.27,t=4.290,P=0.013;72 h时KYSE150 NFE2L2-KO组的细胞增殖活力为8.77±0.51,低于KYSE150组的12.39±1.50,t=3.231,P=0.032;EdU掺入实验结果显示,KYSE150 NFE2L2-KO组细胞增殖能力为(39.96±2.53)%,低于KYSE150组的(55.60±3.60)%,t=5.019,P=0.007。KYSE150 NFE2L2-KO组细胞克隆形成率为(38.26±2.56)%,低于KYSE150组的(68.93±1.76)%,t=13.950,P<0.001。结论应用CRISPR/Cas9基因编辑技术可成功获得NFE2L2敲除的食管鳞癌KYSE150单克隆细胞系,敲除NFE2L2可抑制KYSE150细胞增殖。

脑和肌肉芳香烃受体核转运样蛋白1在食管鳞状细胞癌组织中表达变化及对KYSE150细胞增殖和迁移的影响

目的观察食管鳞状细胞癌(鳞癌)组织脑和肌肉芳香烃受体核转运样蛋白1(brain and muscle ARNT-like protein 1,BMAL1)表达变化,探讨BMAL1对食管鳞癌KYSE150细胞增殖和迁移的影响。方法食管鳞癌患者82例,取手术切除癌组织及癌旁组织,采用实时荧光定量PCR法检测BMAL1 mRNA相对表达量,采用Western blot法检测BMAL1蛋白相对表达量,并进行比较。以癌组织BMAL1 mRNA相对表达量中位数为界,将82例患者分为BMAL1高表达组(BMAL1 mRNA相对表达量≥6.94)37例和BMAL1低表达组(BMAL1 mRNA相对表达量<6.94)45例,比较BMAL1高、低表达组临床病理特征。取对数生长期食管鳞癌KYSE150细胞,分为对照组(转染空载慢病毒)、BMAL1过表达组(转染BMAL1过表达慢病毒)、回复实验组(转染BMAL1过表达慢病毒及BMAL1 shRNA慢病毒),转染72 h,采用实时荧光定量PCR法检测3组细胞BMAL1 mRNA相对表达量,采用Western blot法检测BMAL1蛋白相对表达量,采用CCK-8实验检测细胞增殖的吸光度(optical density,OD)值,采用细胞克隆形成实验检测细胞克隆形成数目,采用细胞划痕实验检测细胞迁移率。结果食管鳞癌组织BMAL1 mRNA及蛋白(6.81±0.62、0.65±0.15)相对表达量均低于癌旁组织(7.74±0.79、0.97±0.13)(P<0.05)。BMAL1低表达组年龄<60岁(80.0%)、T分期T;~T;期(86.7%)、临床分期Ⅱb~Ⅲ期(86.7%)、脉管侵犯(66.7%)、神经侵犯(71.1%)及淋巴结转移(80.0%)比率均高于BMAL1高表达组(48.6%、54.1%、54.1%、43.2%、32.4%、29.7%)(P<0.05),性别、肿瘤直径、病理分级与BMAL1高表达组比较差异均无统计学意义(P>0.05)。BMAL1过表达组细胞BMAL1 mRNA及蛋白相对表达量(11.03±0.56、0.83±0.09)均高于对照组(9.27±0.48、0.35±0.09)和回复实验组(10.04±0.45、0.44±0.08)(P<0.05);回复实验组细胞BMAL1 mRNA及蛋白相对表达量与对照组比较差异均无统计学意义(P>0.05)。3组细胞转染后培养0 h时细胞增殖OD值比较差异无统计学意义(P>0.05);BMAL1过表达组转染后培养24 h时细胞增殖OD值(0.44±0.03)低于对照组(0.55±0.04)(P<0.05),BMAL1过表达组与回复实验组(0.48±0.12)、回复实验组与对照组比较差异均无统计学意义(P>0.05);BMAL1过表达组转染后培养48、72 h时细胞增殖OD值(0.73±0.04、0.90±0.03)均低于对照组(0.94±0.04、1.23±0.03)和回复实验组(0.86±0.03、1.15±0.05)(P<0.05),回复实验组与对照组比较差异均无统计学意义(P>0.05)。BMAL1过表达组细胞克隆形成数目[(322.88±31.37)个]少于对照组[(517.63±10.51)个]和回复实验组[(494.13±9.46)个](P<0.05),细胞迁移率[(11.67±0.88)%]低于对照组[(32.26±1.41)%]和回复实验组[(29.93±0.14)%](P<0.05);回复实验组细胞克隆形成数目、细胞迁移率与对照组比较差异均无统计学意义(P>0.05)。结论食管鳞癌组织BMAL1呈低表达,提示肿瘤恶性程度高,上调BMAL1表达可抑制食管鳞癌KYSE150细胞增殖和迁移。