应用CRISPR/Cas9技术敲除NFE2L2对食管鳞癌KYSE150细胞增殖的影响

目的采用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建NFE2L2缺失的食管鳞癌KYSE150(KYSE150 NFE2L2-KO)细胞株,观察NFE2L2敲除对食管鳞癌KYSE150细胞增殖的影响。方法应用CRISPR/Cas9基因编辑技术,构建重组NFE2L2_KO_three_gRNA_Cas9表达载体,将表达载体经转化、扩增、质粒抽提、验证和测序。采用Lipofectamine 2000将重组NFE2L2_KO_three_gRNA_Cas9表达载体转入食管鳞癌KYSE150细胞,经Sanger测序验证转染效率后,培养并筛选单克隆细胞株,获得NFE2L2纯合缺失的食管鳞癌KYSE150单克隆细胞株,并通过Sanger测序、逆转录定量-聚合酶链反应(qRT-PCR)和蛋白印迹法实验验证。将NFE2L2缺失的KYSE150单克隆细胞株设为KYSE150 NFE2L2-KO组,KYSE150单克隆细胞株设为KYSE150组。采用细胞计数试剂法(CCK-8)和克隆形成实验观察NFE2L2敲除对食管鳞癌KYSE150细胞增殖的影响。结果Sanger测序验证结果表明NFE2L2_KO_three_gRNA_Cas9表达载体构建成功以及NFE2L2基因第二外显子上37 kb碱基纯合缺失KYSE150单克隆细胞株成功获得。KYSE150 NFE2L2-KO组,蛋白印迹法未检测到NFE2L2蛋白表达。KYSE150 NFE2L2-KO组中NFE2L2 mRNA表达水平为0.36±0.03,低于KYSE150组的1.04±0.12,t=10.660,P<0.001;CCK-8实验结果显示,48 h时KYSE150 NFE2L2-KO组的细胞增殖活力为4.38±0.31,低于KYSE150组的5.62±0.27,t=4.290,P=0.013;72 h时KYSE150 NFE2L2-KO组的细胞增殖活力为8.77±0.51,低于KYSE150组的12.39±1.50,t=3.231,P=0.032;EdU掺入实验结果显示,KYSE150 NFE2L2-KO组细胞增殖能力为(39.96±2.53)%,低于KYSE150组的(55.60±3.60)%,t=5.019,P=0.007。KYSE150 NFE2L2-KO组细胞克隆形成率为(38.26±2.56)%,低于KYSE150组的(68.93±1.76)%,t=13.950,P<0.001。结论应用CRISPR/Cas9基因编辑技术可成功获得NFE2L2敲除的食管鳞癌KYSE150单克隆细胞系,敲除NFE2L2可抑制KYSE150细胞增殖。