NCOR2基因通过调控PI3K/AKT通路促进食管鳞状细胞癌KYSE450细胞迁移和侵袭

目的:探究核受体辅阻遏物2(NCOR2)基因对食管鳞状细胞癌(ESCC)发生发展的影响及其潜在的分子调控机制。方法:收集2017年5月至2018年7月间在山西省肿瘤医院确诊的155例ESCC患者的癌及癌旁组织标本及临床资料,利用患者的转录组和临床病理数据进行生存预后分析及临床关联性分析。采用qPCR法检测6种ESCC细胞(TE-1、TE-5、TE-9、KYSE150、KYSE180和KYSE450)中NCOR2基因的表达水平,筛选NCOR2基因高表达的KYSE450细胞进行siRNA敲低实验,构建敲降NCOR2的细胞模型。利用CCK-8、克隆形成、细胞划痕和Transwell实验检测敲低NCOR2对KYSE450细胞增殖活性、克隆形成、迁移和侵袭能力的影响。对NCOR2敲低的KYSE450细胞进行转录组测序分析,筛选差异表达基因,进行GO和KEGG富集分析,解析NCOR2可能影响的信号调控网络。结果:NCOR2在ESCC组织中表达水平显著高于癌旁组织(P<0.01),NCOR2高表达ESCC患者的预后较差(P<0.05)。敲低NCOR2基因表达后,KYSE450细胞划痕愈合率、迁移和侵袭能力均显著降低(均P<0.01),对细胞的增殖活力及克隆形成能力均无显著影响(均P>0.05)。在KYSE450细胞中敲低NCOR2基因后,转录组测序分析后发现54个基因发生了显著上调、127个基因发生了显著下调。KEGG分析发现,显著差异基因富集于PI3K/AKT分子信号通路(P<0.01),该通路中的4个基因PIK3R3、IL4R、COL1A1、EFNA1的表达水平在155例ESCC患者临床样本的转录组数据中与NCOR2呈显著正相关(均P<0.01),与转录组测序结果相吻合。结论:NCOR2可以通过影响PI3K/AKT信号通路并促进KYSE450细胞迁移与侵袭,进而影响ESCC的发生与发展。

miR-199a-3p对Eca109和KYSE450细胞周期和迁移的影响

目的:观察miR-199a-3p对食管鳞癌细胞周期及迁移能力的影响,并探讨其分子机制。方法:常规培养Eca109和KYSE450细胞,分别转染miR-199a-3p mimics及miR-199a-3p mimics negative control(阴性对照)。采用qRT-PCR法检测3组细胞中miR-199a-3p的表达水平,并用流式细胞术及划痕实验分别检测细胞周期及细胞迁移能力,用Western blot检测细胞中m TORC2信号通路相关蛋白[m TOR、Rictor、PI3K、p-Akt(T308)、p-Akt(S473)]的表达。结果:与阴性对照相比,转染miR-199a-3p mimics后,Eca109和KYSE450细胞中miR-199a-3p表达量增加;G1期细胞增多,细胞相对迁移率降低,m TOR和Rictor蛋白的表达水平降低,而PI3K、p-Akt(T308)和p-Akt(S473)蛋白的表达水平升高(P均<0.05)。结论:miR-199a-3p可能通过调控m TORC2信号通路来影响食管鳞癌细胞周期进程及细胞迁移。

豆根管食通口服液对食管鳞癌细胞miR-377的影响研究

目的观察豆根管食通口服液对食管鳞癌细胞株KYSE450的细胞增殖、细胞凋亡及对miR-377、CD133和VEGF表达的影响。方法先制备豆根管食通口服液含药血清,然后分为高中低三个浓度,分别作用24 h、48 h、72 h,筛选出最佳浓度和最佳作用时间,然后将KYSE450细胞株分为空白组、豆根管食通中剂量组、氟尿嘧啶组。采用MTT方法检测豆根管食通口服液含药血清对KYSE450细胞增殖的影响,采用流式细胞仪检测豆根管食通口服液含药血清对KYSE450细胞凋亡的影响,采用RT-PCR方法检测豆根管食通口服液含药血清对KYSE450细胞miR-377的影响,采用WB方法检测豆根管食通口服液含药血清对KYSE450细胞CD133和VEGF表达的影响。结果筛选出最佳浓度为豆根管食通中剂量组,最佳作用时间为48 h;MTT结果显示,豆根管食通口服液对KYSE450细胞能够明显抑制细胞增殖,豆根管食通口服液含药血清中剂量组的细胞凋亡率为(18.8±2.66)%,高于空白组(P <0.01),促进miR-377表达,与空白对照组相比(P <0.05),抑制CD133表达(P <0.05),抑制VEGF表达(P <0.01)。结论豆根管食通口服液对食管鳞癌KYSE450细胞株有抗增殖、促凋亡的作用,其机制可能是通过上调miR-377的表达,进而抑制CD133和VEGF表达。

稳定过表达幼虫巨大致死基因2(LLGL2)的食管鳞癌细胞系的建立

目的构建人幼虫巨大致死基因2(LLGL2)慢病毒表达载体,并建立稳定表达的人食管鳞癌KYSE450细胞系和TE-1细胞系。方法 PCR扩增人LLGL2全长基因序列,连接插入至pCDH-CMV-IRES-GFP-EF1-Puro慢病毒载体中,并对重组质粒进行双酶切及测序验证。将重组质粒pCDH-CMV-LLGL2-IRES-GFP-EF1-Puro和PHR、水疱性口炎病毒G蛋白(VSVG)共转染HEK293T细胞进行病毒包装,利用该病毒液感染KYSE450细胞和TE-1细胞。经嘌呤霉素筛选建立LLGL2稳定过表达的KYSE450细胞系和TE-1细胞系,用Western blot法检测LLGL2的表达情况。结果双酶切和测序分析,成功构建pCDH-CMVLLGL2-IRES-GFP-EF1-Puro慢病毒表达载体质粒。Western blot法检测结果显示,与对照组相比,感染病毒液的细胞LLGL2蛋白水平明显增高。结论成功建立了稳定过表达LLGL2基因的KYSE450细胞系和TE-1细胞系。

Claudin-2蛋白在食管鳞癌组织中的表达及其对KYSE-450细胞恶性生物学行为的影响

目的:分析Claudin-2蛋白在食管鳞癌(esophageal squamous cell carcinomas,ESCC)组织中的表达及其与患者临床病理特征、5年生存率的关系,探索其对ESCC细胞KYSE450的增殖、迁移和侵袭的影响。方法:选取河南省肿瘤医院2010至2013年间初治的ESCC患者手术切除肿瘤组织52例及其中20例对应的癌旁组织标本,采用免疫组化和WB法检测Claudin-2的表达并分析其与患者临床病理特征和5年生存率的关系。WB法检测ESCC细胞(KYSE450、KYSE150、KYSE510、KYSE140)和人永生化食管上皮细胞SHEE中Claudin-2的表达,构建Claudin-2 shRNA慢病毒载体并转染KYSE450细胞构建敲低Claudin-2表达的细胞系,进一步通过克隆形成实验、细胞划痕实验及Transwell实验检测敲低Claudin-2对KYSE450细胞增殖、迁移和侵袭的影响。结果:ESCC组织中Claudin-2阳性率显著高于癌旁组织(P<0.05),ESCC组织中Claudin-2的表达与淋巴结转移有关(P<0.05)。Claudin-2表达阳性患者5年生存率显著低于阴性者(P<0.05)。成功构建敲低Claudin-2表达的KYSE450细胞系。sh-Claudin-2组细胞的克隆形成数、伤口愈合率和侵袭细胞数均显著低于sh-NT组和对照组(P<0.05)。结论:ESCC组织中Claudin-2的表达高于癌旁组织,且与患者5年生存率呈负相关,Claudin-2能够增强KYSE450细胞的增殖、迁移和侵袭能力。

壁虎粗多肽诱导食管癌KYSE450细胞凋亡机制研究

目的研究壁虎粗多肽(GCP)体外对食管癌KYSE450细胞的增殖抑制作用。方法取对数生长期细胞,种板,用不同浓度的(0.10,0.15,0.20,0.25,0.30,0.35,0.4,0.45,0.50,0.55,0.6 mg·mL^(-1))GCP处理KYSE450细胞24,48,72 h,通过噻唑蓝比色法(MTT)检测细胞增殖,根据MTT结果,将实验分组为空白组(0)和低、中、高3个浓度(GCP:0.1,0.15,0.22 mg·mL^(-1))实验组与对照组(10μg·mL^(-1)阿霉素)。以免疫印迹法检测GCP对KYSE450细胞内B淋巴细胞瘤-2基因(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-9(Caspase-9)蛋白表达的影响。结果 GCP处理KYSE450细胞24,48,72 h后,半数抑制浓度(IC_(50))值分别为0.32,0.28,0.24 mg·mL^(-1)。空白组和低、中、高3个浓度实验组与对照组的Bax与Bcl-2灰度比值平均分别为(23.83±0.07)%,(51.08±0.78)%,(148.26±6.19)%,(329.33±4.44)%,(115.84±0.26)%;这5组的Caspase-9与甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)灰度比值平均分别为(14.81±1.05)%,(20.91±1.24)%,(39.61±1.89)%,(43.68±1.13)%,(39.82±0.69)%;这5组的Caspase-3与GAPDH灰度比值平均分别为(6.37±0.51)%,(10.97±0.50)%,(13.44±0.49)%,(17.03±0.49)%,(8.63±0.42)%。以上各项指标,与空白组比较差异均有统计学意义(P<0.05,P<0.01)。结论 GCP可抑制KYSE450细胞增殖并诱导其凋亡,其机制与Caspase依赖性途径有关。