Jiepx METTL3介导KLK6的m6A修饰促进胃癌细胞的细胞活力

目的探讨甲基转移酶样3(METTL3)是否介导Kallikrein相关肽酶6(KLK6)的N6-甲基腺苷(m6A)修饰促进胃癌细胞的细胞活力。方法通过m6A抗体纯化胃癌细胞MGC⁃803和正常胃细胞GES⁃1中的m6A修饰的mRNA,通过实时荧光定量PCR检测这些mRNA中KLK6的相对表达量。过表达或敲低METTL3后纯化m6A修饰的mRNA,通过实时荧光定量PCR检测这些mRNA中KLK6的相对表达量。通过体外转录和METTL3体外催化KLK6的mRNA的m6A修饰。在METTL3敲低的胃癌细胞MGC⁃803中转染体外合成的m6A修饰的KLK6的mRNA,通过MTT检测胃癌细胞MGC⁃803的细胞活力。结果胃癌细胞MGC⁃803中mRNA的m6A修饰多于正常胃细胞GSE⁃1,并且胃癌细胞MGC⁃803中KLK6 mRNA的m6A修饰多于正常胃细胞GSE⁃1(P<0.05)。过表达MET⁃TL3后,胃癌细胞MGC⁃803中KLK6 mRNA的m6A修饰多于正常胃细胞GSE⁃1(P<0.05)。敲低METTL3后,胃癌细胞MGC⁃803中KLK6 mRNA的m6A修饰少于正常胃细胞GSE⁃1(P<0.05)。敲低METTL3并转染体外合成的m6A修饰的KLK6的mRNA后,胃癌细胞MG⁃803的细胞活力上升(P<0.05)。结论胃癌细胞MGC⁃803中,METTL3通过对KLK6 mRNA进行m6A修饰促进细胞活力。

人源SPINK6在大肠杆菌中的表达优化

丝氨酸蛋白酶抑制剂Kazal型6(serine protease inhibitor Kazal-type 6,SPINK6)蛋白是医学上的重要蛋白。为了高效制备具有生物活性的SPINK6蛋白,使用大肠杆菌表达系统重组表达SPINK6蛋白,经过纯化和酶切后测定了其生物活性,并对其表达条件进行了优化。结果表明,飞行时间质谱测得产物的分子量为6061.51 Da,通过此法成功制备获得了重组SPINK6蛋白,并且重组SPINK6蛋白对激肽释放酶相关肽酶5(kallikrein-related peptidase 5,KLK5)(K i=3.02±0.26 nmol/L)和KLK14(K i=1.85±0.05 nmol/L)有较强的抑制作用,具有生物活性。采用pE-SUMO3质粒为载体,在菌体OD 600=0.4时加入1 mmol/L异丙基-β-D硫代半乳糖苷(Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside,IPTG)诱导表达3 h,重组SPINK6蛋白获得最大表达量,1 L培养液中获得重组SPINK63.32 mg。研究结果可为SPINK6蛋白功能及应用研究提供操作性强的制备方法和稳定的蛋白来源。