K-银环蛇毒素对小鼠被动学习和空间记忆的影响

以Ｋ－银环蛇毒素（Ｋ－ＢＧＴ，３．２５μｇ／ｋｇ）海马内注射可造成小鼠胆碱能神经Ｎ受体功能受损的学习记忆的障碍。水迷宫检测结果表明，Ｋ－ＢＧＴ组小鼠空间学习记忆明显下降，训练第４天，逃避潜伏期比第１天下降仅为１６．７％，而对照组逃避潜伏期比第１天下降达５８．３％。在第５天６轮共６０次训练中，对照组在规定时间内找到平台的百分数为８０．０％，而Ｋ－ＢＧＴ组仅为３３．３％。撤去平台后第１天，对照组穿越原平台所在部位的次数为（５．３±２．８）次，而Ｋ－ＢＧＴ仅为（１．９±１．２）次。此外搜寻平台方式构成方面也出现了明显变化。避暗测试结果表明，Ｋ－ＢＧＴ组比对照组潜伏期下降３８．３％，错误率比对照组增加了２．２５倍。卵磷脂４０ｍｇ／ｋｇ经胃灌服１４天对Ｋ－ＢＧＴ所致学习记快损伤具有一定的改善作用。

α-银环蛇毒素基因的克隆及其非融合型原核表达

根据文献报道α-银环蛇毒素的氨基酸序列推导出其DNA序列,设计并人工合成两两互补的14条寡核苷酸片段。经片段延伸、PCR、克隆,成功构建α-银环蛇毒素基因克隆质粒;质粒经XbaⅠ和EcoRⅠ双酶切回收后连接于表达载体pET28a(+)中,分别转化BL21(DE3)、BL21(DE3)Codon plus、BL21(DE3)plysS进行诱导表达,表达产物经Tris/tricine系统进行SDS-PAGE分析。结果表明:该基因已在大肠杆菌BL21(DE3)宿主菌中进行了非融合表达,其表达量占细菌总蛋白的11.98%,主要以包涵体形式存在;同时对表达条件进行了优化,其表达量可达16.28%。经Western blot分析,在大约8 kDa处出现明显的目的带,与预计蛋白分子量大小一致,说明表达产物与天然α-银环蛇毒素具有相似的免疫原性。表达产物纯化、复性后经动物毒性试验表明:表达的α-银环蛇毒素蛋白具有生物学活性,小鼠腹腔注射其LD50约为1.28μg/g。

重组α-银环蛇毒素P22-A31的原核表达及功能分析

α-银环蛇毒素在神经科学研究以及在临床和制药上有重要作用,为获得大量的α-银环蛇毒素,我们用已构建的pGEX-BgTX(P22-A31)质粒在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,并用谷胱甘肽Sepharose FF纯化GST-α-银环蛇毒素融合蛋白,再用凝血酶切掉融合标签谷胱苷肽转移酶(Glutathione S-transferase,GST),得到了较纯的重组α-银环蛇毒素同工毒素,得率约为1.225mg/L。用重组α-银环蛇毒素制备多克隆抗体,经ELISA和Western杂交鉴定后可知重组α-银环蛇毒素与天然α-银环蛇毒素的抗原性一致。小鼠毒性试验表明,重组α-银环蛇毒素同工毒素的半致死剂量LD50为1.598mg/kg,约为天然α-银环蛇毒素的1/5。小鼠化学法镇痛试验显示,重组α-银环蛇毒素有一定的镇痛药效,1/4LD50剂量的镇痛百分率为55.2%,1/8LD50剂量的镇痛百分率为20.5%,在外周镇痛作用中呈一定的量效关系。

重组α-银环蛇毒素的纯化及活性分析

以表达重组α-银环蛇毒素的高效表达菌株BL21(PDZ04)为材料,研究重组α-银环蛇毒素(α-bungarotoxin,α-BgTx)的分离纯化.采取亲和色谱和离子交换色谱的方法都得到了重组α-银环蛇毒素的纯品.首先从天然的银环蛇毒干粉中分离纯化得到了天然α-银环蛇毒素的纯品.然后以天然α-银环蛇毒素为对照来检测重组α-银环蛇毒素的抗原性和毒性.ELISA结果显示其具有与天然α-银环蛇毒素相似的抗原性,以小鼠为动物模型,纯化的重组α-银环蛇毒素与天然α-银环蛇毒素相比,其腹腔注射的LD50也基本一致,约为0.22μg/g.结果表明利用基因工程的方法生产蛇神经毒素是可行的.

增溶抽提β－银环蛇毒素结合蛋白及某些突触前毒素对其结合的抑制作用

β－银环蛇神经毒素阻遏神经肌肉接头递质释放的作用机理，可能与它结合于一种突触前的电压依赖的Ｋ~＋通道有关。本文报告了从大鼠膈肌膜组分中用去垢剂ＴｒｉｔｏｎＸ－１００增溶抽提β－银环蛇毒素结合蛋白的结果。这种结合蛋白抽提液的比结合活性为２００－４００ｆｍｏｌ／ｍｇ蛋白，比膜制备物的比结合活力提高约一倍。抽提得率为５０％－７０％。抽提液与^（１２５）Ｉ标记的β－银环蛇毒素的结合可被曼巴蛇神经毒素（ｄｅｎｄｒｏｔｏｘｉｎ）完全抑制，其ＩＣ_（５０）约８×１０^（－８）ｍｏｌ／Ｌ。但另一种β型神经毒素，β－蝮蛇神经毒素（β－ａｇｋｉｓｔｒｏｄｏｔｏｋｉｎ）却完全不能抑制这种结合。这提示，β－蝮蛇毒素与β－银环蛇毒素具有不同的作用位点。

银环蛇心脏毒素类似物cDNA的克隆

采用SMART技术和RT PCR方法,从同一个银环蛇毒腺中克隆到了5种尚未报道过的心脏毒素类似物全长cDNA序列(MNCTL1 a、MNCTL1 b、MNCTL1 c、MNCTL1 d和MNCTL2)。5种序列中,MNCTL1 b、MNCTL1 c、MNCTL1 d和MNCTL2的长度均为505bp,包括5′非翻译区32bp,3′非翻译区212bp和其余261bp组成的一个完整开放阅读框;MNCTL1 a由于3′非翻译区24bp的缺失,全长cDNA仅为481bp。所得序列编码区部分与已报道的银环蛇心脏毒素类似物(cardiotoxin likeprotein)编码区cDNA序列的同源性达95.8%以上。我们克隆到的序列编码85个氨基酸组成的心脏毒素类似物前体,包括20个氨基酸的信号肽和65个氨基酸的成熟肽,与已知的心脏毒素类似物氨基酸组成有很高的同源性。运用AntheportV4.5软件分析,发现编码的蛋白质与眼镜蛇毒中心脏毒素有相似的结构和性质,推测它们可能有类似心脏毒素的功能。本研究首次报道了从同一个体的银环蛇毒腺中克隆到多个心脏毒素类似物全长cDNA序列,提示银环蛇心脏毒素类似物基因在该种蛇基因组中有多个拷贝,并在毒腺细胞中同时转录。

银环蛇毒素及其基因工程研究进展

文章阐述了银环蛇毒素的特性、成分、蛋白质结构及其 c DNA和基因组 DNA,以及各种银环蛇毒素的克隆和表达研究概况。α,β、κ和γ-银环蛇毒素在结构上具有高度的同源性 ,在应用研究方面具有特殊的功能 ,主要应用在医学药理学、分子生物学和分子免疫学等方面。由于银环蛇毒分子量小 ,活性强 。

α-银环蛇毒素基因的克隆与表达

与传统的捕蛇或养蛇提毒的方法相比,利用基因工程方法生产蛇神经毒素具有明显的潜在优势。本研究结合国内外的研究现状,以α-银环蛇毒素(α-bungarotoxin,α-BgTx)为例子来探讨蛇神经毒素基因在大肠杆菌表达体系中的表达情况及其规模生产的可行性。首先根据文献报道α-银环蛇毒素的氨基酸序列,推导出其DNA序列并设计成部分互补的4条寡核苷酸片段,利用DNA合成仪人工合成、纯化其寡核苷酸片段,通过片段退火、切口补平、连接、克隆、测序鉴定获得了α-银环蛇毒素基因;然后将α-银环蛇毒素基因克隆至pGEX-2T质粒中分别转化大肠杆菌DH5(和JM109进行表达分析,融合蛋白约占细菌总蛋白的30％～40％,其中部分为可溶性表达,部分以包含体的形式表达;对可溶性表达的条件进行了优化。最后以天然纯化的α-银环蛇毒素作为对照,分析融合方式表达的重组α-银环蛇毒素的活性,ELISA结果显示其与天然的α-银环蛇毒素比较具有相似的抗原性。

K－神经毒素是银环蛇（Bungarusmultictus）蛇毒的基本成分

利用层析法分别从浙江、湖南和安徽产银环蛇毒中纯化得到的Ｋ－神经毒素（Ⅵ１ｂ和Ⅷ１ａ峰），分子量均为６５００．两个Ｋ一神经毒素在浓度１５０ｎｍｏｌ／Ｌ都能有效地阻断小鸡睫状神经节的烟碱传递，经２小时冲洗仍未见神经节传递功能的恢复。可以认为Ｋ一神经毒素是银环蛇蛇毒的基本成分。

α-银环蛇毒素融合基因表达载体的构建及原核表达

设计并人工合成2条引物,对作者构建的重组质粒pMD-α-BGT进行PCR扩增获得α-BGT基因。将目的基因连接至pUCm-T载体构建克隆质粒pUCm-α-BGT。克隆质粒经BamHⅠ、NotⅠ双酶切后连接至融合蛋白表达载体pGEX-4T-1中,成功构建融合基因表达载体pGEX-α-BGT,转化大肠杆菌BL21(DE3)进行IPTG诱导表达。表达产物经15%SDS-PAGE分析,在约34ku处可见明显的外源蛋白质表达带,与预计的分子量大小一致,其表达量约占细菌总蛋白的32.6%。Westernblotting和间接ELISA检测结果表明,α-BGT的融合表达蛋白与天然α-BGT标准品具有相似的抗原性。

κ-银环蛇毒素敏感的烟碱受体激活引起的去甲肾上腺素释放参与烟碱诱导的长时程增强样反应(英文)

烟碱可以增强学习记忆功能,但其相关机制仍不清楚。海马长时程增强被认为是学习记忆的细胞机制。本研究室以往研究表明,当单脉冲的强度为诱发80%最大群体锋电位时,烟碱(10μmol/L)可以在海马CA1区诱导长时程增强样反应。本文通过细胞外记录离体海马脑片CA1区锥体细胞层群体锋电位,探讨烟碱诱导长时程增强样反应所涉及的烟碱受体亚型与相应的神经递质释放。结果显示,烟碱诱导的长时程增强样反应可以被美加明(mecamylamine,1μmol/L)或κ-银环蛇毒素(κ- bungarotoxin,0.1μmol/L)阻断,但不被dihydro-β-erythtroidine(DHBE,10μmol/L)阻断。烟碱诱导的长时程增强样反应可以被普萘洛尔(propranolol,10μmol/L)阻断,但不被酚妥拉明(phentolamine,10μmol/L)或阿托品(atropine,10μmol/L)阻断。以上结果提示,κ-银环蛇毒素敏感的烟碱受体激活引起的去甲肾上腺素释放参与烟碱诱导的海马CA1区长时程增强样反应。

β-银环蛇神经毒素结合蛋白的分离纯化

大鼠膈肌神经突触前膜上存在 β -银环蛇毒素结合蛋白。膈肌经匀浆、去垢剂抽提、离子交换层析、植物凝集素亲和层析及银环蛇毒素亲和层析 ,可获得纯化的 β -银环蛇毒素结合蛋白。其比结合活性达 1nmol/mg蛋白质。整个纯化过程的总得率为 3%。纯化蛋白制品的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱显示 ,有两个共纯化的多肽链 ,其分子量分别为 6 1和 6 9kD。

江西产银环蛇毒中K-神经毒素的分离纯化

利用 3次阳离子层析法从江西产银环蛇毒中分离得到 2个相对分子质量均为 6 50 0的K -神经毒素 进一步证实了K -神经毒素是银环蛇毒的基本成分 K -神经毒素是目前唯一的可用于烟碱受体分型的工具 它可高效地识别α3β2

重组α-银环蛇毒素的纯化及活性分析

以表达重组α-银环蛇毒素的高效表达菌株BL21(PDZ04)为材料,研究重组α-银环蛇毒素(α-bungarotoxin,α-BgTx)的分离纯化。采取亲和色谱和离子交换色谱的方法都得到了重组α-银环蛇毒素的纯品。参考文献报道的方法从天然的银环蛇毒干粉中分离纯化得到了天然α-银环蛇毒素的纯品。然后以天然α-银环蛇毒素为对照来检测重组α-银环蛇毒素的抗原性和毒性。ELISA结果显示其具有与天然α-银环蛇毒素相似的抗原性,以小鼠为动物模型,纯化的重组α-银环蛇毒素与天然α-银环蛇毒素相比,其腹腔注射的LD50也基本一致,约为0.22μg/g。结果表明利用基因工程的方法生产蛇神经毒素是可行的。

α-银环蛇毒素对中枢烟碱诱发小鼠惊厥效应的影响

１００μｇ／ｋｇα－银环蛇毒素（α－Ｂｕｎｇａｒｏｔｏｘｉｎ，α－ＢＧＴ）对大鼠脑室内注射烟碱５０μｇ／ｋｇ引起的惊厥反应的抑制率为４０％，ｄ－筒箭毒ＥＤ５０为１２．７μｇ／ｋｇ，六烃季胺ＥＤ５０为２２８．２μｇ／ｋｇ．在人工呼吸条件下，以烟碱引起的脑皮层电图去同步化为指标，１３０μｇ／ｋｇα－ＢＧＴ对烟碱效应的抑制率可达６０％，烟碱引起脑皮层电图低频区域的变化受到α－ＢＧＴ的明显影响．

功能化超顺磁性Fe3O4纳米微粒的制备及在β-银环蛇毒素检测中的应用

采用微波共沉淀法制备超顺磁性Fe3O4纳米粒子并对其进行功能化修饰，探讨了制备功能化β—BGT磁性纳米微粒的最佳工作条件，建立了双抗体夹心磁分离酶免疫分析法检测β-BGT，结果表明，制备的功能化β—BGT磁性纳米微粒具有良好的活性，每mg磁微粒固定的生物素标记β—BGT多抗最大量为925μg。双抗体夹心磁分离酶免疫分析法检测β-BGT线性范围为0．062～125μg／L，线性回归方程为Y=0．705X＋1．017（R^2=0．991，n=12，P〈0．0001），检测限为O．062μg／L，具有较好的重现性。不同浓度的蓖麻毒素、相思子毒素、葡萄球菌肠毒素B对检测结果基本无干扰。

银环蛇毒素对白血病K562细胞株凋亡诱导作用的研究

目的 探讨银环蛇毒素及其若干组分在体外对白血病K 5 62细胞株的凋亡诱导作用。方法 采用阳离子交换层析法分离纯化银环蛇粗毒 ,应用MTT法、荧光显微镜和流式细胞术等研究毒素对K 5 62细胞株的凋亡作用。结果 除Ⅵ峰毒素外 ,银环蛇粗毒及分离的部分组分Ⅳ峰、Ⅶ峰和Ⅷ峰等毒素的荧光显微图未见特征性的凋亡小体 ,DNA含量分布组方图中的二倍体峰前未见G1细胞群。结论 银环蛇毒对K 5 62细胞具有杀伤作用 ,但并非是细胞凋亡作用 ,而是致细胞坏死 ,而粗毒中的某些组分可能具有促K 5

α-银环蛇毒素同工毒素基因的克隆和表达

α银环蛇毒素是存在于银环蛇蛇毒中的一种长链神经毒素,能与神经递质受体特异性结合,因此它不仅是神经信号传导机制研究的重要分子探针,更具有开发治疗某些神经性疾病新型药物的可能性。用SMART技术,反转录合成银环蛇毒腺cDNA,克隆并测定了α银环蛇毒素基因,得到14种mRNA序列;进而将其中一种新的α银环蛇毒素基因亚克隆到原核表达载体pQE30a和pGEX4T1中,在大肠杆菌中通过IPTG诱导表达,其中带有GST融合蛋白的重组质粒αBgTX(P22A31)/pGEX4T1在BL21菌株中得到高效表达,表达量占菌总蛋白的30%,可溶形式存在的融合蛋白大于25%。

阻断神经节烟碱乙酰胆碱传递的P－银环蛇毒素

从安徽产银环蛇毒中提纯一分子量为１５０００的毒素，命名为Ｐ一银环蛇毒素，该毒素在浓度为１μｇ／ｍｌ时，可阻断豚鼠腹下神经一输精管标本的神经节的传送，抑制率为８６％，经长时间冲洗后，稍有逆转，但从刺激至反应的潜伏期明显延长。ａ一眼环蛇毒囊无上述作用。Ｐ一眼环蛇毒素与国外报导的ＢＧＴⅡ一Ｓ＿１：、ＢＧＴｐ一４，Ｐ＿（１５）等毒素的特性相似，可望成为研究神经元烟碱受体的探针。