长心卡帕藻RAPD-PCR反应体系的正交优化研究

采用SD(S十二烷基硫酸钠,20%)法提取了大型海藻长心卡帕藻(Kappaphycus alvarezii)基因组DNA。通过单因子梯度试验,确定了影响随机扩增DNA多态性(RAPD)扩增结果的模板、Mg2+、dNTPs、S22引物、Taq的适宜浓度、退火温度和反应的最佳循环次数;利用正交试验优化了模板、Mg2+、dNTPs、S22引物、Taq的配比浓度。结果表明,在进行长心卡帕藻的RAPD扩增时,在总体积为25μl的反应体系中,模板、Mg2+、dNTPs、S22引物、Taq的最佳浓度分别为15ng、2.0mmol/L、0.2mmol/L、0.25μmol/L、2.5U;退火温度为37℃。反应程序为94℃预变性5min,然后经94℃变性30s、37℃退火1min,72℃延伸2min,进行30次循环,最后在72℃再延伸10min。

长心卡帕藻多糖的超声提取工艺优化及其抗过敏活性

为获得一种长心卡帕藻多糖的最佳提取工艺并测定抗过敏活性,该研究在单因素实验的基础上,以长心卡帕藻的多糖得率作为考察指标,选择料液比、超声波预处理时间、提取时间进行响应面优化实验,确定最佳工艺条件,并通过DEAE-52纤维素层析柱对提取的粗多糖进行纯化。随后利用RBL-2H3细胞模型,分别测定纯化后的长心卡帕藻多糖对RBL-2H3细胞活力、细胞脱颗粒抑制及细胞组胺释放水平调节的影响。结果表明,响应面优化后的长心卡帕藻多糖的最佳提取工艺如下:料液比(w/v)为1:92 g/mL,超声波预处理时间为40 min,提取时间为4 h,最佳提取工艺条件下,长心卡帕藻多糖提取率为13.92%。经DEAE-52纤维素层析纯化后的组分KSP(Kappaphycus alvarezii Sulfated Polysaccharides)在50~1200μg/mL浓度范围内对RBL-2H3细胞活力均未表现有显著性抑制作用,无细胞毒性;浓度为25、50及100μg/mL的KSP对经2,4-二硝基苯基白蛋白偶联物(2,4-Dinitrophenyl-Bovine Serum Albumin,DNP-BSA)刺激后的RBL-2H3细胞的β-氨基己糖苷酶酶活抑制率分别为36.3%、37.0%和51.7%,对其组胺释放抑制率分别为17.5%、18.3%和42.0%。综上,本试验得到的工艺参数具有可行性,KSP对RBL-2H3细胞无明显毒性,并表现出显著的脱颗粒和组胺的释放抑制作用,具有较好的体外抗过敏活性。该研究可为以长心卡帕藻为原料开发具有抗过敏活性的营养功能性食品提供参考。

长心卡帕藻ISSR-PCR反应体系的正交优化研究

采用CTAB法提取了大型经济海藻长心卡帕藻(Kappaphycus alvarezii)的基因组DNA。通过单因子梯度试验,确定了影响简单重复序列间区(ISSR)扩增结果的模板、Mg^(2+)、dNTPs、引物、Taq DNA聚合酶的适宜浓度、退火温度和反应的最佳循环次数;利用正交试验优化了模板、Mg^(2+)、dNTPs、引物、Taq DNA聚合酶的配比浓度。结果表明:在进行长心卡帕藻的ISSR扩增时,在总体积为20μl的反应体系中,模板、Mg^(2+)、dNTPs、引物、Taq DNA聚合酶的最佳浓度分别为15ng、2.7mmol/L、0.2 mmol/L、0.1 mmol/L、1.5 U;退火温度为48℃。反应程序为94℃预变性5 min,然后经94℃变性50 s、48℃退火1 min,72℃延伸2 min,进行32次循环,最后在72℃再延伸8 min。结果为卡帕藻属和麒麟菜属类海藻的遗传多样性、种质鉴定、分子标记及辅助育种等研究提供了有用的手段。