荒漠植物花花柴HTR基因家族表达模式及其增强细菌抗逆性分析

【目的】荒漠植物花花柴具有耐盐碱、耐高温等优异的广谱抗逆性,是新疆珍贵的天然抗逆植物种质资源。挖掘花花柴耐极端温度和耐盐基因,系统分析其在高温、低温和高盐胁迫下表达模式以及抗逆性,对于利用该基因增强作物抗逆性、稳产性、丰产性,促进荒漠植物基因资源的发掘利用都具有重要意义。【方法】采用盆栽花花柴幼苗进行不同时长的高温(45℃)、低温(4℃)和高盐(400 mmol/L Na^(+))胁迫处理,采集幼苗的根、茎、叶组织,利用RT-PCR等技术克隆花花柴HTR基因家族(KcHTRs),分析KcHTRs基因表达情况,同时通过原核表达体系分析其抗逆性以及表达蛋白质的最佳诱导条件。【结果】(1)从荒漠植物花花柴高温转录组数据中筛选并克隆了KcHTR基因家族的7个成员,通过构建原核表达载体并诱导表达,明确其cDNA长度在708~789 bp之间,所表达的蛋白质分子量在27~29 kD之间;(2)发现在大肠杆菌BL21最适生长温度37℃下该家族蛋白的最佳诱导表达体系:OD600为0.8,IPTG诱导浓度为0.5 mmol/L,诱导时间为8~10 h;(3)通过对重组大肠杆菌的模拟高温、低温、盐胁迫处理,结果显示KcHTRs能够在一定程度上增强宿主对高温、低温和高盐的耐受性。【结论】KcHTRs具有优异的广谱抗逆性,主要具有耐极端温度的抗逆性,且能够积极响应花花柴植株应对逆境胁迫。

花花柴地上部分化学成分的研究

目的研究花花柴Karelinia caspia(Pall.)Less地上部分的化学成分。方法花花柴地上部分甲醇提取物采用硅胶、Sephadex LH-20及反相MCI色谱进行分离纯化,根据理化性质及波谱数据鉴定所得化合物的结构。结果从中分离得到13个化合物,分别鉴定为柽柳素(1)、万寿菊素(2)、山柰酚(3)、棕矢车菊素(4)、金圣草黄素(5)、槲皮素(6)、芹菜素(7)、对羟基桂皮酸脂-4-O-β-D-吡喃糖苷(8)、4′,3,5,7,-四羟基-3′-6二甲氧基黄酮(9)、木犀草素(10)、蒲公英甾醇醋酸酯(11)、豆甾醇(12)、单棕榈酸甘油酯(13)。结论化合物2~5、7、10、13为首次从该植物中分离得到。

沙埋对策勒绿洲-沙漠过渡带两种建群种植物特征与格局的影响

以塔克拉玛干沙漠南缘策勒绿洲-沙漠过渡带为研究区,在半固定沙地、半流动沙地和流动沙地选择了3个50 m×50 m的典型样地,分别代表轻度、中度和强度3种沙埋条件。每个样地内确定植物种类组成,测定两种建群种植物的高度和冠幅,同时对相应的灌草丛沙堆进行形态测量;利用全站仪采集所有植物的空间点坐标数据,运用Ripley’s K(t)函数点格局分析,研究沙埋对两种建群种植物特征与格局的影响。结果表明:随着沙埋强度的增加,疏叶骆驼刺和花花柴两个建群种植株数量减小,数量比例从以花花柴为主向以骆驼刺为单优势种群方向发展,死亡植株比例从半固定沙地的14.5%升高到流动沙地的40.3%;疏叶骆驼刺和花花柴植株高度和冠幅从半固定沙地到半流动沙地有所降低,但疏叶骆驼刺在流动沙地中又表现出增加趋势;对应的灌草丛沙堆体积随沙埋强度增加而变大,沙堆形态从多种类型并存向带有风影沙尾的蝌蚪形为主转变;花花柴和骆驼刺均以聚集分布应对风积沙埋的威胁,两种植物的种群间关系并不明显。总体来看,风积沙埋有碍于两种建群种植物的繁殖与生长,但骆驼刺具有更强的耐沙埋能力,特别是在流动沙地中留存下来的骆驼刺植物单体明显大于半固定和半流动沙地。集群分布的植物沙堆往往从基部合并,导致相对密集的植物分布区总与局部凸起的地形相对应,是风沙环境中植物群体与风积沙埋相互作用的结果。

花花柴化学成分的研究

目的研究花花柴Karelinia caspia(Pall.)Less的化学成分。方法采用硅胶、Sephadex LH-20凝胶和反相RP-18色谱柱,对花花柴乙酸乙酯提取物进行分离纯化,通过波谱数据鉴定所得化合物的结构。结果从中分离出12个化合物,分别鉴定为Δ5,22-豆甾醇3-O-β-D-葡萄糖吡喃糖苷(1)、蒲公英甾醇醋酸酯(2)、cyclomusalenone(3)、φ-蒲公英甾醇(4)、taraxast-20-ene-3β,30-diol(5)、豆甾醇(6)、槲皮素(7)、4',3,5,7-四羟基-3',6-二甲氧基黄酮(8)、柽柳素(9)、芹菜素(10)、4β-acetoxy-3β-angeloyloxy-7,11-dehydroeudesman-8-one(11)、3β-angeloyloxy-4α,11-dihdroxy-6,7-dehydroeudesman-8-one(12)。结论所有化合物均为首次从该植物中分离得到。

沙漠植物花花柴幼苗对高温耐受性评价

为开发利用沙漠植物花花柴的耐高温特性,就花花柴对高温耐受性进行了探测。采用不同的温度(40、45和50℃)处理花花柴幼苗,分别在不同温度的不同处理时间段用传统方法测定了花花柴幼苗的相对电导率和MDA含量、SOD、POD和CAT的活性变化,台盼蓝组化染色面积,并利用隶属函数法综合分析了这几个指标对评价花花柴对高温耐受性的可靠性。结果显示,(1)花花柴幼苗在40℃条件下,随着胁迫时间延长,叶片相对电导率和MDA含量呈先升高后降低的趋势,其保护酶系统的活性随处理时间的延长逐渐升高,台盼蓝染色几乎无着色。(2)在45℃条件下,处理2-8 h时间段,各项生理指标变化不显著,而在处理12 h以后,相对电导率、MDA含量显著增加,保护酶活性显著降低;台盼蓝染色面积随着处理时间的延长逐渐增大。(3)在50℃处理时,花花柴幼苗叶片的MDA含量、相对电导率逐渐升高,且呈显著水平,其保护酶活性在处理1 h时达到最高,之后显著降低;台盼蓝染色面积随着处理时间的延长逐渐增大、着色变深。通过隶属函数法综合分析表明这5个指标可作为花花柴耐高温性的评价指标,且花花柴对40℃不敏感,对45℃可耐受8 h左右,对50℃能耐受1 h左右,表明花花柴对高温具有极强的耐受性。

花花柴叶片解剖结构与生态环境关系的研究

通过光学显微镜和扫描电镜观察和研究了花花柴叶的形态解剖结构及其与生态环境的关系。结果表明 ,花花柴是典型的泌盐植物 。

盐旱胁迫对花花柴种子萌发与幼苗生理生化特性的影响

为探明花花柴(Karelinia caspica)种子萌发和幼苗对盐旱胁迫的耐受性,采用不同浓度的PEG-6000溶液和NaCl溶液模拟盐旱胁迫,研究盐旱胁迫对花花柴种子萌发及幼苗保护酶活性、相对电导率和丙二醛(MDA)含量的影响。结果表明,1)花花柴种子最终萌发率随着NaCl和PEG胁迫程度的升高而降低,低浓度胁迫下的种子最终萌发率与对照无显著差异(P>0.05);当PEG质量分数大于20%、NaCl溶液浓度大于100mmol·L-1时,各处理下的种子最终萌发率差异显著(P<0.05)。2)NaCl浓度为200~300mmol·L-1和PEG质量分数为5%~15%胁迫下的花花柴幼苗叶片丙二醛(MDA)含量、过氧化物酶(POD)活性、超氧化物歧化酶(SOD)活性和过氧化氢酶(CAT)活性随着胁迫时间延长逐渐升高;当幼苗在400~500mmol·L-1 NaCl和25%的PEG胁迫下时,叶片MDA含量随着胁迫时间延长逐渐升高;POD、SOD和CAT活性随着胁迫时间延长先升高后降低。可见,花花柴对逆境环境具有较强的适应能力;25%的PEG为其耐旱临界值,300mol·L-1 NaCl为其耐盐临界值。

生境、温度及外源激素对花花柴花器官发育的影响

植物花器官的生长发育与温度密切相关,高温会导致花器官畸形及体内激素含量的变化。为探究不同生境配合外施生长素(IAA)对花花柴(Karelinia caspia)花器官发育的影响,测定沙漠和人工绿地2种环境下及外施不同浓度生长素(IAA)的花花柴花器官大小(雌花花柱、雄花花丝)及花器官内激素含量的变化。结果表明,在花苞期合适的温度(27-30℃)能够促进花花柴花器官的生长,而在开花过程中,高温(38-40℃)可促进花花柴柱头伸长进而影响花器官生长,直至发育成熟。外施一定浓度的IAA对花花柴花器官的生长具有促进作用,沙漠环境中,外施0.3 μmol/L的IAA促进作用最明显而人工绿地则为0.1 μmol/L。

花花柴蜡质合成相关基因KcFAD2的克隆及转基因烟草耐高温性鉴定

本研究从花花柴高温表达谱中筛选并克隆蜡质合成相关基因KcFAD2,构建亚细胞定位载体转化烟草进行瞬时表达。亚细胞定位结果表明,绿色荧光主要集中在细胞膜上,并且能够与膜Marker的红色荧光发生共定位,说明KcFAD2蛋白定位在细胞膜上。通过在烟草中超表达KcFAD2基因,结果表明高温处理后KcFAD2转基因烟草的形态学表型、可溶性糖含量和脯氨酸含量均显著高于阴性对照植株,并且其耐高温能力KcFAD2与基因的表达量呈正相关,蜡质含量上升。说明超表达KcFAD2基因提高了烟草的耐高温能力,对荒漠植物抗逆基因资源的挖掘与利用具有应用参考价值。

策勒绿洲-沙漠过渡带两个建群种阻沙能力对比研究

以塔克拉玛干沙漠南缘策勒绿洲-沙漠过渡带为研究区,在区域内确定了一个100 m×500 m的骆驼刺—花花柴—柽柳植物群落样地,随机选择了67株疏叶骆驼刺和67株花花柴植株,对每株植物及其沙堆形态参数进行测量,对比分析两个建群种草本植物形态和沙堆形态特征及其相互关系与植物的阻沙能力。结果表明:两种灌草丛植物地面植株平均高度和沙堆的平均高度均相近,但骆驼刺灌丛的平均冠幅面积和冠幅体积,分别是花花柴灌丛的近1.8倍;灌丛沙堆的平均底面积和体积,分别是花花柴沙堆的近1.7倍和2.0倍。骆驼刺灌丛沙堆形态参数间的相关性明显高于花花柴沙堆,骆驼刺灌丛沙堆的底面积及体积的增长幅度较花花柴大。总体而言,骆驼刺灌丛具有更强的空间占有能力,对地表的防护作用面积大,植物个体阻沙能力强。但在两种植物生长的早期阶段,花花柴则显示出较强的阻沙性能,说明不同生长阶段两种植物的阻沙能力大小存在差异。

短期环割对塔克拉玛干沙漠南缘两种荒漠植物的生理影响

随着气候条件的改变,人口和载畜量的日益增加,塔克拉玛干沙漠南缘策勒绿洲主要植物种群花花柴(Karelinia caspia)和骆驼刺(Alhagi sparsifolia)正遭受日益严重的虫噬、放牧等机械损伤的影响,干扰因子对花花柴和骆驼刺的影响日趋明显。以塔克拉玛干南缘沙漠策勒绿洲主要建群种花花柴和骆驼刺为材料,测量了韧皮部环割处理10天后,光合色素含量和光系统II(PSII)叶绿素荧光的变化。结果表明:(1)在韧皮部半割处理下,花花柴、骆驼刺的光合色素含量和叶绿素荧光变化都不明显。(2)在韧皮部全割处理下,花花柴、骆驼刺的光合色素含量和叶绿素荧光各参数变化较大,在该处理下,两种植物光合原初反应被抑制,PSII结构和功能遭到损害,活性降低,光合器官对光能的吸收、传递、转化和电子捕获等过程被抑制。(3)韧皮部全割对花花柴和骆驼刺各生理状况产生较大影响,相比而言,环割对花花柴的影响更为持久。对于单个植株而言,机械损伤对花花柴的破坏损伤更为显著。(4)在环割对花花柴和骆驼刺光合速率的影响中,存在着依赖于碳水化合物(carbohydrate-dependent)的机制。

花花柴中一个新的苯丙素苷

采用硅胶柱色谱、反相RP-18柱色谱等方法,从花花柴中分离得到3个苯丙素衍生物及3个其他苯环衍生物,其中化合物1为新的苯丙素苷类化合物,命名为花花柴素A。通过深入分析1D和2D NMR图谱以及质谱,确定了分离得到化合物的结构。

盐生植物花花柴KcSOS1基因RNA干扰遗传转化体系构建及其功能初步鉴定

盐生植物花花柴(Karelinia caspia)适应盐碱生境的主要策略是通过叶片盐腺将体内积聚过多的Na^+排出体外而避免盐害,以增强其耐盐性。然而,花花柴泌盐分子机制仍不清楚。研究表明,质膜Na^+/H^+逆向转运蛋白SOS1介导的Na^+外排可能在其泌盐过程中起重要作用。基于此,本研究以花花柴叶片总RNA为模板,采用反转录PCR方法获得了KcSOS1干扰片段。采用In-Fusion无缝连接方法,构建了CaMV35S启动子驱动的含有KcSOS1片段反向重复序列的RNA干扰(RNAi)植物表达载体pART27-KcSOS1-RNAi(PKR)。最后,通过农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)介导法,将PKR转入花花柴,经抗性筛选及分子检测获得了KcSOS1-RNAi转化株系。初步证实,盐胁迫下KcSOS1-RNAi株系叶片Na^+分泌速率较野生型明显降低。实验结果为揭示KcSOS1在花花柴泌盐中的作用提供参考。

高温-干旱对沙漠植物花花柴光合作用的影响

为了探索高温-干旱胁迫对荒漠植物光合作用的影响,通过测定高温-干旱胁迫时花花柴光合作用的变化,来解释花花柴耐高温-干旱的生物学特性。本实验利用LI-6400XT光合仪测定三种环境(绿地常温,绿地高温,沙漠高温)中花花柴的胞间CO2浓度(Ci)、净光合速率(Pn)、蒸腾速率(E)及气孔导度(gs)。结果表明一天之中花花柴的净光合速率和蒸腾速率,在绿地常温环境中于16点到19点时达到最高,此时的环境温度为33℃~34℃,同时间段沙漠高温环境中净光合速率相对降低了88.2%,蒸腾速率相对增高了2.15倍;胞间CO2浓度和气孔导度,在绿地常温环境中于11点到13点会达到最高,此时环境温度为25℃~28℃,同时间段沙漠高温环境中二者都呈现出显著下降趋势。表明高温使花花柴的光合指数都有不同程度的降低,但是干旱胁迫的叠加加剧了高温对花花柴光合作用的负效应,且在净光合速率、蒸腾速率、胞间CO2浓度的实验数据中表现明显,从而可以解释花花柴耐高温-干旱的生物学特性。

韧皮部环割诱导下的花花柴衰老机制

衰老是植物器官和组织发育的最后阶段,是一个受到严格控制的高度协调过程,其中碳水化合物浓度对衰老的影响十分显著。花花柴(Karelinia caspia)是塔克拉玛干沙漠南缘策勒绿洲的主要植物种,为了研究花花柴在韧皮部环割后的碳水化合物变化和叶片衰老过程,对其进行韧皮部环割,测量叶片光合色素含量、光合速率、可溶性糖含量、淀粉含量、脱落酸(ABA)含量和叶水势。结果表明:(1)环割能够诱导花花柴叶片的衰老,而诱导叶片衰老的主要因素有:叶片碳水化合物的积累、叶片ABA含量的上升,以及叶片水分状况的恶化。(2)相比于自然衰老,环割诱导的衰老导致许多正常的生理过程受到破坏。(3)类胡萝卜素在衰老过程中主要起光保护的作用。(4)韧皮部半环割也导致花花柴各种生理指标显著下降,表明植物无法通过增加剩余部分韧皮部筛管的运输通量而达到维持整个韧皮部运输系统顺畅的目的。

花花柴蜡质合成相关基因的克隆及分析

植物表皮蜡质是由脂肪酸、烷烃、醇类等物质组成的一类有机混合物,在植物抵御逆境胁迫中起着至关重要的作用。为深入研究花花柴(Karelinia caspica)蜡质合成相关基因P450-77A,HHT和FAD2的结构与功能,运用分子克隆技术,获得花花柴蜡质合成相关基因P450-77A和HHT和FAD2的CDS全长,命名为KcP450-77A,KcHHT和KcFAD2,Genebank登录号分别为MW528399,MW528400和MW528401。并对以上基因的编码蛋白进行生物信息学分析,利用RT-PCR技术对其在高温处理下不同时间点进行表达模式分析。结果发现KcP450-77A全长1521bp,编码507个氨基酸;KcHHT全长1347 bp,编码449个氨基酸;KcFAD2全长1152 bp,编码384个氨基酸。通过对上述3个基因在高温处理下不同时间点的表达模式分析发现,3个基因的表达均表现为高-低-高的趋势,其中,KcP450-77A基因在40℃处理8 h时表达量最高,KcHHT基因在处理4 h时表达量最高,KcFAD2基因在处理16 h时表达最为显著。本研究结果表明,花花柴表皮蜡质合成相关基因的表达受高温影响,表现出胁迫-诱导-适应的特性,这种应激反应与植物受到环境胁迫时的生理反应一致。

花花柴KcbHLH71基因的克隆及表达分析

高温胁迫可引起植物体内生长素类激素含量和活性变化,也可影响其生理生化过程进而产生胁迫蛋白以提高自身抵抗或适应逆境的能力。根据高温胁迫下花花柴转录组测序分析结果,发现生长激素合成相关基因bHLH显著上调,通过PCR克隆获得该基因碱基序列,命名为KcbHLH71,并利用定量PCR对高温胁迫下该基因的表达模式进行分析。结果显示,花花柴KcbHLH71基因完整ORF为1 038 bp,编码345个氨基酸,分子量大小为38.8 kD,pI为6.8;编码蛋白含有b HLH蛋白家族的特征基序列和保守结构域,有信号肽,无跨膜结构,定位于细胞核。系统发育结果显示花花柴KcbHLH71与菊科的向日葵、莴苣bHLH71蛋白的相似性分别为88%和83%,即认为它们同源性最高,亲缘关系最近。表达分析结果显示,高温胁迫下,花花柴KcbHLH71基因2 h的表达量受到最大抑制,之后逐渐上升,当12 h时达到高峰,12～24 h再次出现下降,但仍高于对照水平。以上研究结果表明,高温可以显著诱导KcbHLH71基因的表达,推测该基因可能参与花花柴响应高温胁迫的正调控。