基因芯片快速检测结核分枝杆菌katG基因突变及其与异烟肼耐药相关性

目的了解结核分枝杆菌katG基因S315突变与异烟肼(isoniazid,INH)耐药相关性,建立快速简便的katG基因S315突变基因芯片检测方法。方法采用二倍稀释法检测123株结核分枝杆菌临床分离菌株对INH的耐药性。PCR及测序确定上述结核分枝杆菌katG基因S315位点突变率及突变类型。根据PCR及测序结果,设计Cy3荧光标记探针并制备katG基因S315位点突变检测基因芯片。基因芯片检测结果与PCR及测序结果进行对比分析。结果 123株结核分枝杆菌临床菌株中,39.0%(48/123)菌株对INH敏感,61.0%(75/123)菌株对INH耐药。结核分枝杆菌H37Rv株及所有临床菌株均能扩增出katG基因片段。75株INH耐药菌株中,69.3%(52/75)菌株katG基因出现S315位突变,其中25株突变类型为S315N(AGC→AAC)、12株为S315T(AGC→ACC)、7株为S315I(AGC→ATC)、各有3株分别为S315T(AGC→CGC)和S315R(AGC→AGA)、2株为S315G(AGC→GGC)。所制备的基因芯片对123株结核分枝杆菌katG基因S315野生型或突变型检测结果与PCR及测序结果完全一致。结论结核分枝杆菌katG基因S315突变与INH耐药密切相关。本研究中制备的基因芯片可快速、简便、准确、敏感和特异地检测结核分枝杆菌katG基因S315突变及其类型。

吉林省耐多药结核分枝杆菌rpoB及katG基因突变特征分析

目的分析吉林省耐多药结核分枝杆菌临床分离株rpoB、katG基因突变特点,为建立本省快速耐多药检测方法提供参考。方法对吉林省耐多药结核分枝杆菌菌株扩增rpoB、katG基因测序后比对分析。结果耐多药结核分枝杆菌rpoB、katG基因的突变率分别为83.53%和70.6%,突变类型包括点突变、联合突变和缺失。在rpoB基因中,82.30%突变发生在RRDR区域,最常见突变位点为rpoB 531、rpoB 526、rpoB 516。KatG基因突变率为70.6%,最常见突变位点为katG315,占所有突变的68.55%。结论吉林省耐多药结核分枝杆菌最常见突变位点为rpoB531、rpoB 526、rpoB 516和katG 315。

聚合酶链反应-单链构象多态性技术检测耐多药结核分支杆菌rpoB、KatG、rpsL突变的研究

目的 应用PCR SSCP技术快速检测耐INH ,RFP ,SM结核分支杆菌分离株KatG、rpoB、rpsL基因突变 ,评价其在检测结核分支杆菌耐药性方面的价值。方法 32株耐INH、RFP、SM结核分支杆菌临床分离株及 2 5株结核分支杆菌敏感分离株用PCR SSCP方法分别检测 ,rpoB、KatG、rpsL基因突变。结果 32株耐多药结核分支杆菌分离株中 ,rpoB、KatG、rpsLPCR扩增产物PCR SSCP分别有 2 8株 (87.5 % )rpoB基因 ,19株 (5 9.3% )KatG基因和 2 3株 (71.9% )rpsL基因电泳条带与结核分支杆菌标准株H3 7Rv电泳条带相比有明显差异 ,而 2 5株结核分支杆菌敏感株的PCR SSCP条带与结核分支杆菌H3 7Rv相似 ,特异性为 10 0 %。结论 PCR SSCP方法敏感、特异 ,可快速检测结核分支杆菌rpoB、KatG、rpsL耐药基因突变 。

TaqMan-MGB荧光定量PCR快速检测结核分枝杆菌katG基因突变

目的建立一种特异、灵敏、快速检测结核分枝杆菌katG基因突变的TaqMan-MGB荧光定量PCR方法。方法根据结核分枝杆菌katG基因315位点突变的特点,设计一对特异性TaqMan-MGB探针和引物,通过反应条件优化,建立荧光定量PCR方法;用克隆到PMD18-T载体上katG基因阳性标准品及不同菌株来评价该方法的特异性、敏感性和重复性。结果灵敏度高,检测目的基因的最低检测下限10copies/μL,比常规PCR灵敏高100倍;特异性高,检测16株非结核分枝杆菌标准株和7种常见呼吸道感染细菌的标准株均为阴性;与测序法相比,野生型和突变型探针的敏感性和特异性均为100%。重复性好,批内批间CT值变异系数均小于1%。结论 TaqMan-MGB荧光定量PCR的方法能特异、灵敏、快速检测结核杆菌菌株katG315位点突变。

PCR-SSCP技术直接快速检测痰标本中结核分支杆菌rpoB,katG,ahpC基因突变的研究

目的应用PCR -SSCP技术直接快速检测痰标本中结核分支杆菌rpoB ,katG及ahpC基因突变 ,评价此方法用于结核分支杆菌利福平 (RFP)及异烟肼 (INH)耐药性试验的意义。方法以结核分支杆菌H3 7Rv为对照 ,30例耐RFP(单耐或多耐 )、2 1例耐INH(单耐和多耐 )的结核分支杆菌临床分离株及 10例敏感菌株 ;39例菌阳肺结核患者及 30例非结核性肺部疾病患者痰标本 ,采用PCR SS CP技术检测痰标本和菌株中的结核杆菌rpoB ,katG ,ahpC基因突变 ,并与药敏试验对照。结果PCR -SSCP检测痰标本中结核分支杆菌rpoB ,katG及ahpC基因突变的阳性率分别为 79% (31/ 39)、46 % (18/39)及 5 % (2 / 39)。结论PCR -SSCP可望成为直接检测临床痰标本中结核分支杆菌耐利福平及耐异烟肼的快速方法。

尘肺并发结核患者耐多药结核分枝杆菌L型异烟肼耐药基因katG序列突变特点分析

目的探讨淮南矿区尘肺并发结核患者感染耐多药结核分枝杆菌(multiple drugs resistant Mycobacterium tuberculosis,MDR-MTB)L型异烟肼耐药基因katG突变特点。方法收集114株MTB菌L型临床分离株,用药敏试验鉴定MDR-MTB菌L型;抽提MDR-MTB L型和H37Rv标准菌株DNA,PCR法扩增katG基因,并对katG基因的突变集中区域进行测序分析。结果从114株临床分离株中检出MDR-MTB菌L型31株(27.2%),其katG基因突变率为61.3%(19/31);主要集中在315位点碱基置换突变,以Ser315Thr为主(AGC→ACC)(48.4%,15/31),其次是315位点Ser315Asn(AGC→AAC)突变(9.7%,3/31)以及431位点Ala431Val(GCG→GTG)突变(3.2%,1/31),未发现多位点联合突变,12株(38.7%,12/31)未发现katG基因突变;随机检测的10株异烟肼敏感株未见katG基因单链构象异常。结论淮南矿区尘肺并发结核患者感染的MDR-MTB菌L型异烟肼耐药情况较为严重,高度保守的katG基因突变是导致异烟肼耐药的分子基础,其突变位点呈多样性。

结核杆菌异烟肼表型耐药与katG基因突变相关性研究

目的:探讨结核分支杆菌异烟肼(INH)表型耐药与KatG基因密码子315位和463位基因改变的相关性。方法:采用基因直接测序法对结核分支杆菌分离株KatG基因进行分析。结果:132株异烟肼耐药菌株中68株KatG基因密码子315位有基因突变,突变率51.52%(68/132),野生型密码子315AGC(Ser)突变成ACC(Thr)60株,AAC(Asn)6株,ACA(Thr)1株,GGC(GIy)1株。133株INH敏感菌株未发现KatG 315位基因突变。132株INH耐药菌株中123株KatG基因密码子463位有基因突变,突变率为93.18%,野生型密码子463CGG(Arg)突变成CTG(Leu)123株;133株敏感菌株中114株KatG基因密码子463位有基因突变,突变率为85.71%,野生型密码子463 CGG(Arg)突变成CTG(Leu)114株。结论:①KatG基因315位密码子突变是菌株异烟肼表型耐药的重要分子基础,以Ser315Thr错义突变为主。②KatG基因463位密码子突变与异烟肼耐药表型没有相关性,不是结核杆菌异烟肼耐药的分子标志。该位点突变可能是基因多态性,与结核菌治疗带来的选择性压力无关。

痰中耐药结核分枝杆菌katG基因的快速检测及异烟肼耐药机制研究

目的快速检测痰中耐药结核分枝杆菌katG基因及了解耐异烟肼的分子机制。方法用PCR方法直接从耐药肺结核患者痰及临床分离菌株扩增katG基因片段,对扩增获得的katG基因片段进行序列测定,比较分析耐多药、全耐、多耐药但对异烟肼敏感、全敏感或标准结核分枝杆菌株之间的基因序列差异。结果于6 h内从耐药肺结核痰中快速检测到katG基因。从临床分离菌株中随机扩增药敏试验证实的耐多药3株,全耐、包括对异烟肼耐药的多耐、对异烟肼敏感的多耐药、全敏感及H37Rv标准结核分枝杆菌株各1株,均扩增获得273bp片段,序列测定比较发现,2株耐多药菌、1株全耐菌及包括异烟肼耐药的多耐药菌株均检测有katG基因点突变,突变位点均为第2066位碱基C突变为G,1例MDR-TB、全敏感株、对异烟肼敏感的多耐药菌株和标准株均无基因突变。结论PCR及序列分析方法可快速、准确检测结核分枝杆菌katG基因及其突变,结核分枝杆菌对异烟肼的耐药性与katG基因点突变有关,但可能还存在其它值得探讨的机制。

应用分子信标检测MTB耐异烟肼katG基因315codon点突变的实验研究

目的:选择结核杆菌耐异烟肼katG基因包含315codon点突变序列,设计分子信标探针,建立扩增体系及分子信标芯片检测方法。方法:运用软件Beacon designer设计katG基因包含315codon的分子信标,建立其扩增体系及分子信标芯片检测方法,应用荧光显微镜观测荧光信号。结果:标准株及耐异烟肼PCR产物与分子信标杂交后荧光信号区别明显;28株耐异烟肼组与10株H37RV标准株对照组荧光信号强度比较,耐异烟肼组315codon突变检出率为44%。结论:分子信标技术是一种高灵敏的核酸点突变检测技术;采用荧光显微镜观测荧光信号,具有更强的荧光信号识别、放大功能及结果判断更准确等优点。

肺痨康抗耐异烟肼结核的分子机制与katG基因突变的关系初探

目的初步探讨肺痨康抗耐异烟肼结核杆菌的分子机制与kat G基因突变的关系。方法将耐异烟肼肺结核模型小鼠随机分为空白组、模型组、异烟肼组、肺痨康组、联合用药组,并设标准菌株组。造模成功后,灌胃56 d后,观察并记录小鼠一般体征和体重变化,取出相同部位肺脏组织,HE染色观察小鼠肺组织病理变化,提取部分样本结核杆菌DNA,进行全基因测序,观察kat G基因突变位点变化。结果各治疗组的病理损伤均明显轻于模型组异烟肼组见结核小节形成,肺痨康组及联合用药组未见典型结核结节,全基因测序发现模型组、异烟肼组、肺痨康组以及联合组kat G基因第315、463位密码子由AGC、CGG突变为ACC、CTG,标准菌株未显示kat G基因突变。结论肺痨康可以改善耐异烟肼结核小鼠的生存状态,减少肺组织的炎性反应,其发挥作用的分子机制与kat G基因回复突变相关性较弱。

结核分支杆菌KatG基因表达质粒的构建及其在大肠杆菌中的表达

目的 克隆与结核分支杆菌耐异烟肼密切相关的KatG基因 ,实现其在大肠杆菌中的表达并对其酶活性进行初步检测。方法 构建含KatG基因的表达质粒 pET2 4b KatG ,转化大肠杆菌BL2 1 (DE3)菌株 ,获得稳定的高表达菌株后对表达产物进行过氧化氢酶活性的初步检测。结果 限制性内切酶分析结果显示所构建的 pET2 4b KatG表达质粒已成功克隆了KatG基因。含pET2 4b KatG表达质粒的大肠杆菌在导丙基硫代 β D 半乳糖苷(IPTG)诱导下表达 ,对表达产物进行SDS PAGE ,发现KatG表达产物相对分子质量约为 80× 1 0 3 ,表达产物约占总蛋白量的 1 7.7%。表达产物检测具有过氧化氢酶活性。结论 克隆并在工程菌中表达了异烟肼耐药密切相关的KatG基因 ,表达产物具备过氧化氢酶活性。可藉此方法研究结核分支杆菌的耐药机制。

结核分枝杆菌及其稳定L型的katG基因研究

目的探讨细胞壁缺陷对结核分枝杆菌异烟肼敏感性的影响以及结核分枝杆菌细胞壁缺陷形成异烟肼耐药性的分子基础。方法采用非高渗培养基体外药敏试验,检测自发形成及诱导形成的结核分枝杆菌稳定L型的异烟肼敏感性；用异烟肼耐药性相关结构基因katG的特异性引物,对自发形成及诱导形成的结核分枝杆菌稳定L型及其亲代细菌型的染色体DNA进行PCR扩增与序列分析。结果不论对异烟肼敏感还是耐药的结核分枝杆菌自发或诱导形成稳定L型后,都能够在含0.2μg/ml异烟肼的非高渗液体培养基内生长和传代培养。结核分枝杆菌稳定L型katG基因PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳,可见形成与其亲代细菌型一致的DNA条带。PCR-DS分析结果显示,结核分枝杆菌稳定L型katG基因扩增产物具有与其细菌型相同的核苷酸序列。结论无论是自发形成的还是异烟肼诱导形成的结核分枝杆菌稳定L型都可形成异烟肼耐药性,但其katG基因的核苷酸序列并没有发生改变。提示结核分枝杆菌稳定L型的异烟肼耐药性与katG基因突变无关,细胞壁缺失也是导致结核分枝杆菌形成异烟肼耐药性的一个重要机制。

聚合酶链反应-测序技术快速检测耐异烟肼结核分枝杆菌KatG基因突变的研究

目的应用PCR-DNA测序技术快速检测耐异烟肼结核分枝杆菌分离株KatG基因突变,评价其在检测结核分枝杆菌异烟肼耐药性方面的应用价值。方法47株耐异烟肼结核分枝杆菌临床分离株及30株结核分枝杆菌敏感分离株用PCR-DNA测序技术检测KatG基因突变。结果47株耐异烟肼结核分枝杆菌分离株中,有31株KatG基因检出有突变,突变检出率为66.0%(31/47);30株结核分枝杆菌敏感株检出1株KatG基因突变。结论PCR-DNA测序技术方法敏感、准确、特异,可快速检测结核分枝杆菌KatG耐药基因突变,有利于耐异烟肼结核分枝杆菌耐药性的快速检测。

结核分枝杆菌KatG-ACT271CCT(Thr271Pro)突变与异烟肼耐药关系的研究

目的 探讨结核分枝杆菌katG ACT271CCT(Thr271Pro)基因点突变对异烟肼耐药性的影响。方法 应用基因克隆技术合成野生型katG、突变型katG(AGC315ACC)和katG(ACT271CCT)基因片段,分别重组至质粒pET22b(+),转入表达菌BL21(DE3)pLySs,IPTG诱导目的蛋白表达,亲和层析法对目的蛋白分离纯化。最终检测重组katG蛋白过氧化物酶及过氧化氢酶活性。此外,通过软件AutoDock4.0采用半柔性对接方式分别模拟野生型katG蛋白、Thr271Pro突变型katG蛋白与异烟肼相互作用。结果 成功获得纯化katG重组蛋白。相比野生型katG蛋白(过氧化氢酶活性361.5 U/mg和过氧化物酶活性77.6 U/mg),Thr271Pro突变型katG蛋白过氧化氢酶和过氧化物酶活性分别下降56%和63%(158.8 U/mg和28.7 U/mg),而Ser315Thr突变型katG蛋白过氧化氢酶和过氧化物酶活性分别下降74%和75%(96.2 U/mg和19.7 U/mg)。分子对接结果提示,异烟肼与Thr271Pro突变型katG蛋白结合自由能较野生型升高,Thr271Pro突变蛋白与异烟肼结合的亲和性降低。271位氨基酸突变后,Thr271Pro突变型katG蛋白氧化反应活性空腔发生一定的变形。结论 katG Thr271Pro基因突变引起katG蛋白酶活性部分缺失和氧化反应活性空腔发生变形,导致异烟肼耐药。

牛结核分支杆菌临床分离株rpsL,rpoB,KatG基因突变分析

采用噬菌体生物扩增法对本实验室分离鉴定的25株奶牛结核分支杆菌进行药敏分析,检测出14株耐链霉素、利福平、异烟肼菌株.用PCR扩增耐药株的rpsL基因片段(370 bp)、rpoB基因片段(213 bp)和KatG基因片段(458 bp),并对目的片段进行测序分析,其中5株耐链霉素菌株的rpsL基因在43位点发生突变,均由赖氨酸密码子(AAG)突变为精氨酸密码子(AGG);5株利福平耐药株的rpoB基因在531位点、526位点、511位点发生突变,其中有3株分离株的rpoB基因在531位点发生点突变,1株分离株的rpoB基因在526位点发生突变,1株分离株的rpoB基因在531位点和511位点发生了较为少见的联合突变;4株异烟肼耐药菌株,其中2株在315位点发生碱基突变,2株在463位点发生碱基突变.

牛结核分枝杆菌临床分离株rpoB、KatG基因突变分析

为了解牛结核分枝杆菌临床分离菌株对利福平(RFP)、异烟肼(INH)的分子耐药机制,本研究采用噬菌体生物扩增法对分离并鉴定的25株牛结核分枝杆菌进行药敏分析,筛选出9株耐利福平、异烟肼菌株,PCR扩增耐药株的rpoB基因片段(213bp)和KatG基因片段(458bp)并测序。通过对耐药基因的测序分析,5株利福平耐药株的rpoB基因在531位点(RNA聚合酶β-亚基编码基因起始密码子起,下同)、526位点、511位点发生突变,其中有3株rpoB基因531位点发生突变,1株rpoB基因526位点突变;1株rpoB基因在531位点和511位点发生了较为少见的联合突变;4株异烟肼耐药菌株,其中2株在315位点(KatG蛋白编码基因起始密码子起,下同)发生碱基突变,2株在463位点发生碱基突变。

中国部分地区结核分支杆菌耐利福平、异烟肼和链酶素耐药基因的检测

目的研究我国部分地区耐利福平(RFP)、异烟肼(INH)和链酶素(SM)结核分支杆菌临床分离株rpoB基因、KatGr、psL基因突变情况,评价其耐药分子机制。方法采用PCR和聚合酶链反应-单链构象多态性(PCR-SSCP)对373株结核分支杆菌临床分离株(其中敏感株148株,耐RFPI、NH、SM株共225株)rpoB基因、KatG和rpsL基因进行检测。并对其中19株SSCP阴性的耐RFP株用双脱氧末端终止法进行测序分析。结果安徽省、北京市、上海市、河北省、河南省、辽宁省、吉林省结核分支杆菌耐RFP临床分离株rpoB基因突变率分别为90%、91%、90%、91%、90%、93%、91%;KatG基因突变率分别为69%、63%、71%、68%、67%、68%、65%,rpsL基因突变率71%、69%、74%、68%、70%、61%、76%,分别为经统计学处理不同地区间无显著性差异(χ2=0.46,P>0.05)。同时rpoB基因敏感株均无突变,特异性为100%;KatG基因有3株发生突变,特异性为98%。19株SSCP阴性耐药株中经测序6株在531位密码子TCG→TTG,1株526位密码子CAC→TAC,7株发生在516位密码子GAC→GTC,5株未改变。结论我国不同地区耐利福平、异烟肼和链霉素的rpoB、KatGr、psL耐药基因突变率大致相同,rpoB基因、KatG和rpsL基因突变分别是耐RFP、INH和SM结核分支杆菌耐药性产生的主要分子机制,PCR-SSCP可快速检测结核分支杆菌RFPI、NH和SM耐药性。

PCR-SSCP方法用于痰标本中结核分支杆菌耐药基因的检测

目的探讨采用直接检测结核病人痰标本中rpoB基因和KatG基因突变。评价该方法检测结核分支杆菌对利福平(RFP)和异烟肼(INH)耐药性。方法用PCR-SSCP技术分析,对35例耐INH(或含耐异烟肼)、63例耐RFP(或含耐RFP)的肺结核病人痰标本和20例非结核性肺部疾病组痰标本进行rpoB和KatG基因突变的检测。结果以结核分支杆菌H37RV为对照,63例耐RFP痰标本中57例PCR扩增阳性,其中46例SSCP图谱与H37Rv标准株有差异,rpoB突变率为65.2%。35例耐INH肺结核病人痰标本有20例扩增阳性,15例SSCP图谱与H37Rv标准株有差异,突变率为42.8%。20例非结核病人痰标本rpoB基因和KatG基因扩增均为阴性。结论PCR-SSCP技术有望成为结核分支杆菌耐药性检测的重要方法之一。

耐异烟肼结核分枝杆菌临床分离株耐药基因突变及其分子流行病学调查研究

目的阐明结核分枝杆菌耐异烟肼临床分离株katG基因突变特点以及Spoligotyping分型和结核病流行关系。方法对123株结核分枝杆菌临床分离株,其中有药敏结果的98株,(耐异烟肼菌株45株;异烟肼敏感株53株)的katG基因进行DNA片断扩增然后进行SSCP分析;同时对其中的121株菌株进行Spoligotyping分型。结果45株耐INH结核杆菌株中,27株(60%)第315位点突变,低耐药菌株(1mg/L)第315位点突变率显著高于高耐药菌株(10mg/L;53株敏感株中无KatG基因315位密码子突变。对121株临床株的SpoligotypingDNA指纹分析,1型,(北京型)103株占84%(103/121),其它基因型18株,分散在13种基因型中。结论本项研究进一步证实了结核分枝杆菌耐异烟肼与katG基因突变之间的关系;北京型感染是北京地区结核病流行的重要原因。

基因芯片方法检测耐异烟肼结核分枝杆菌准确性的Meta分析

目的 利用Meta分析方法系统评价基因芯片技术检测耐异烟肼（INH）结核分枝杆菌的准确性。方法 计算机检索The Cochrane Library、SCI、PubMed、EMbase、WanFang Data、CNKI数据库,检索时限均为建库至2015年5月。由2位研究者根据纳入与排除标准筛选文献、提取资料,应用QUADAS条目工具评价纳入研究质量,采用Meta-DiSc 1.4软件对敏感性（SEN）、特异性（SPE）、阳性似然比（＋LR）、阴性似然比（-LR）、诊断比值比（DOR）进行异质性检验和合并分析并绘制受试者工作特征（SROC）曲线、计算曲线下面积（AUC）。结果 共纳入15篇符合要求文献,分析3 967株经传统药敏试验鉴定结核分枝杆菌菌株,其中耐INH菌株1 147株、敏感菌株2 820株。基因芯片技术检测耐INH结核分枝杆菌的SEN_（并发）为0.82[95%CI（0.79~0.84）]、SPE_（并发）为0.97[95%CI（0.97~0.98）]、＋LR为21.81[95%CI（12.12~39.25）]、-LR为0.19[95%CI（0.15~0.24）]、DOR_（并发）为136.55[95%CI（70.66~263.89）],AUC为0.94。结论 通过循证学方法系统评价基因芯片技术检测耐INH结核分枝杆菌结果表明,其具有较好的诊断价值;与传统药敏试验相比基因芯片技术操作简单、检测快速,对耐药基因检出率较高,但费用较贵,成本较高。