肺炎克雷伯菌KbvR调控因子对细菌生物膜与荚膜形成能力的影响

目的构建肺炎克雷伯菌LuxR家族KbvR基因缺失突变株与回补株,分析KbvR在肺炎克雷伯菌生长、生物膜形成及荚膜生成中的作用。方法通过自杀载体p KO3-Km质粒构建KbvR基因敲除株,然后扩增出包含KbvR基因编码区、启动子结合区及转录终止区的基因片段,克隆至p GEM-T-easy质粒上构建KbvR基因回补株。绘制不同菌株生长曲线,了解KbvR对细菌生长的影响。通过结晶紫定量实验检测KbvR基因对细菌生物膜形成的影响,拉丝实验、离心试验及RT-PCR检测KbvR基因对细菌荚膜形成的影响。结果成功获得KbvR基因缺失突变株及回补株,RT-PCR结果显示KbvR基因在缺失突变株中不表达,在回补株中重新表达。KbvR基因不影响细菌的生长速度,基因敲除株后细菌生物膜形成及荚膜生成能力下降。体外试管静止培养48 h,与野生株相比基因缺失突变株生物膜形成能力明显下降,而KbvR基因回补株在液体培养基表面能形成明显生物膜。结晶紫染色定量实验发现,基因缺失突变株生物膜形成能力显著低于野生株(P<0.01)。超粘性实验和RT-PCR结果均显示,KbvR基因缺失突变株荚膜形成能力明显下降,说明KbvR基因影响肺炎克雷伯菌生物膜和荚膜的形成。结论 KbvR基因作为密度感应系统LuxR孤儿调控转录因子,正调控肺炎克雷伯菌生物膜的形成。荚膜是细菌生物膜形成的重要因素,KbvR基因可通过影响荚膜形成而调控生物膜的形成。

肺炎克雷伯菌调控子kbvR在细菌抗吞噬及致病性中作用的研究

目的:研究肺炎克雷伯菌kbvR调控子在调控细菌抗巨噬细胞吞噬功能及致病性中的作用。方法:通过小鼠腹腔感染肺炎克雷伯菌野生株(WT)、kbvR基因敲除株(△kbvR)及kbvR基因回补株(C-kbvR),分析不同菌株腹腔感染LD50及小鼠存活率,同时获取小鼠肺与肝脏进行组织病理检查。腹腔感染不同菌株12 h时取小鼠血液和腹腔灌洗液进行细菌计数及涂片染色镜检,分析腹腔巨噬细胞对不同菌株的吞噬杀菌能力。体外将巨噬细胞RAW264.7与带有GFP质粒的肺炎克雷伯菌共同孵育,激光共聚焦显微镜观察细菌对巨噬细胞的黏附能力。结果:BALB/c小鼠腹腔感染肺炎克雷伯菌野生株、kbvR敲除株、kbvR回补株的LD50分别为≈500 cfu,>5×10^5 cfu,≈1000 cfu。△kbvR感染小鼠存活率明显高于野生株,肝脏病理分析发现野生株感染小鼠肝脏出现炎性细胞浸润及炎性病灶形成,肺部病理分析发现野生株感染小鼠肺部出现淤血。而缺失株感染小鼠肝脏、肺部无明显病理变化。腹腔感染12 h后野生株感染小鼠血液中检测到肺炎克雷伯菌,而敲除株未能检测到;腹腔灌洗液涂片染色镜检在野生株感染的腹腔灌洗液中检测到大量细菌,而敲除株未能观察到,说明当kbvR基因缺失后体内抵抗腹腔巨噬细胞吞噬杀菌能力降低。体外共培养发现肺炎克雷伯菌敲除株黏附能力明显增强,说明kbvR基因可以通过调控细菌对巨噬细胞的黏附而影响巨噬细胞对细菌的吞噬能力。结论:kbvR基因可以通过调控细菌抗巨噬细胞吞噬杀菌能力而影响细菌的致病性。

肺炎克雷伯菌KbvR调控I型菌毛FimH的合成与功能研究

目的明确KbvR对I型菌毛顶端蛋白编码基因fimH的调控作用及其生物学功能。方法在kbvR基因敲除株的基础上构建kbvR与fimH基因的双敲除株,通过扫描电镜、RT-PCR、酵母凝集试验、细胞试验等方法分析在kbvR基因敲除及ΔkbvRΔfimH基因双敲除时细菌I型菌毛的形成、生物膜产生、对吞噬细胞的侵袭能力改变。结果RNA-seq及RT-PCR半定量试验显示kbvR基因敲除株中fimH基因表达增加,扫描电镜及酵母凝集试验显示kbvR基因敲除株菌毛形成能力增强。通过同源重组的方式在kbvR基因敲除株的基础上成功获得ΔkbvRΔfimH双基因敲除株。相对于kbvR基因敲除株,ΔkbvRΔfimH双基因敲除株菌毛形成降低,对抗巨噬细胞吞噬能力提升,但生物膜形成能力无明显变化。结论KbvR对肺炎克雷伯菌I型菌毛FimH蛋白合成起负调控作用,并通过对I型菌毛的合成而影响细菌的抗吞噬能力,但不参与细菌生物膜形成。