牵张应力对人牙周膜细胞MMP-13/TIMP-1表达的影响及其信号转导途径研究

目的研究不同强度机械牵张应力对人牙周膜细胞基质金属蛋白酶-13(MMP-13)及其组织抑制因子-1(TIMP-1)表达的影响,并探讨机械牵张应力作用下人牙周膜细胞MMP-13/TIMP-1表达变化的信号转导途径。方法通过细胞牵张应力加载系统对体外培养的人牙周膜细胞同时施加0%、6%、12%和18%形变率的机械牵张应力,作用24 h后,用RT-PCR方法检测细胞受力后MMP-13/TIMP-1 mRNA表达的变化,用免疫印迹法检测其蛋白表达的变化。另外,通过使用不同信号途径的特异性抑制剂,用RT-PCR方法分别检测不同抑制剂对牵张应力作用下牙周膜细胞MMP-13/TIMP-1 mRNA表达的变化。结果人牙周膜细胞受力后,MMP-13/TIMP-1 mRNA及蛋白表达随牵张应力强度的增大明显增加。PD098059可抑制机械牵张应力作用下牙周膜细胞MMP-13 mRNA表达的增加。放线菌酮可抑制机械牵张应力作用下TIMP-1 mRNA表达的增加。结论不同强度机械牵张应力可以影响人牙周膜细胞MMP-13/TIMP-1的表达,进而影响牙周组织细胞外基质代谢。机械牵张应力作用下MMP-13表达的增加是通过ERK-MAPK途径。机械牵张应力作用下TIMP-1表达的增加是通过新生蛋白途径。

野黄芩苷对内毒素抑制人牙周膜细胞碱性磷酸酶活性的影响

目的观察野黄芩苷对内毒素（LPS）抑制人牙周膜细胞的碱性磷酸酶活性的影响。方法原代培养人牙周膜细胞,采用酶动力学方法观察野黄芩苷对LPS抑制人牙周-膜细胞碱性磷酸酶活性的影响。结果100μg/mL LPS可显著抑制体外培养的人牙周膜细胞碱性磷酸酶活性。加入0.001-10μg/ml野黄芩苷干预后,对LPS抑制碱性磷酸酶活性有一定的拮抗作用,在1μg/ml时达到高峰。结果 野黄芩苷可能通过拮抗LPS抑制牙周膜细胞碱性磷酸酶的活性,促使牙周膜细胞向成骨细胞分化而利于牙周组织再生修复。

茶多酚对脂多糖介导下人牙周膜成纤维细胞MMP-1、MMP-2表达的影响

目的:观察茶多酚(TP)在脂多糖(LPS)介导下对人牙周膜成纤维细胞(HPDLCs)MMP-1、MMP-2表达的影响。方法:体外培养HPDLCs,在培养液中添加TP(200μg/ml)作用于脂多糖(100μg/ml)介导的HPDLCs,培养24、48、72 h,ELISA法检测HPDLCs分泌MMP-1和MMP-2的量。荧光实时定量PCR法检测HPDLCs中MMP-1和MMP-2 mRNA的表达。结果:在LPS介导下HPDLCs MMP-1和MMP-2分泌量和基因表达升高,TP可抑制LPS介导下HPDLCs MMP-1和MMP-2表达。结论:TP可抑制LPS介导的人牙周膜细胞的胶原降解。

大蒜素对人牙周膜成纤维细胞的生物学作用

目的:探讨在不同浓度大蒜素作用下对体外培养的人牙周膜成纤维细胞(human periodontalligament cells,HPDLCs),增殖和总蛋白含量的变化。方法:体外培养人牙周膜成纤维细胞,分别经0(对照组),10-2,10-1,1,10,102,103mg/L浓度的大蒜素作用后,采用MTT法、考马斯亮蓝染色法,观察大蒜素对HPDLCs增殖、总蛋白含量影响。结果:大蒜素浓度在10-2、10-1、1 mg/L时对人牙周膜成纤维细胞增殖和总蛋白含量无明显影响;10、102、103mg/L时明显抑制人牙周膜成纤维细胞增殖和总蛋白含量,且其抑制作用随浓度增大而增强,103mg/L效应最大,呈明显的浓度依赖性(P<0.05)。结论:大蒜素能浓度依赖性抑制人牙周膜成纤维细胞的增殖和蛋白合成。

积雪草酸对人牙周膜细胞增殖、迁移和成骨分化的影响

目的:探讨不同浓度积雪草酸(AA)对人牙周膜细胞(hPDLCs)增殖、迁移和成骨分化能力的影响。方法:以浓度为25、50、100μg/ml的AA处理体外培养的hPDLCs,分别培养1~7d,CCK8法、Transwell小室迁移实验检测各组细胞增殖和迁移能力;ALP和茜素红染色、实时荧光PCR、蛋白免疫印迹检测各组细胞的矿化能力。结果:不同浓度的积雪草酸对人牙周膜细胞的增殖和迁移能力无明显影响。在矿化诱导的条件下,50μg/ml积雪草酸处理的细胞成骨分化能力显著增强。结论:25~100μg/ml的AA不影响hPDLCs的增殖和迁移能力,但50μg/ml时可促进其成骨分化。

尼古丁对人牙周膜细胞基质金属蛋白酶-1、3表达的影响

目的:探讨尼古丁对体外培养人牙周膜细胞(hPDLCs)基质金属蛋白酶-1、3(MMP-1、3)表达的影响及可能机制。方法:采用原代组织块法培养hPDLCs,应用逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)及酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测尼古丁单独及联合应用α7亚型乙酰胆碱受体特异性拮抗剂α-银环蛇毒素(α-BTX)作用下,hPDLCs中MMP-1、3表达的变化。结果:尼古丁(10-4mol/L)作用于hPDLCs,其MMP-1、3mRNA及蛋白表达均有升高(P<0.05),此作用可被α-BTX(1.25×10-9mol/L)拮抗。结论:尼古丁可使体外培养的hPDLCs中MMP-1、3表达升高,此过程可能由α7nAChR通路介导。

白藜芦醇减轻LPS诱导的牙周膜细胞损伤并抑制TLR4/NF-κB活化

目的:探究白藜芦醇(RES)对脂多糖(LPS)诱导的人牙周膜细胞(hPDLCs)损伤的保护作用。方法:体外培养并鉴定hPDLCs,将培养的hPDLCs随机分为5组:对照组、LPS(10μg/ml)+RES(0、30、60、90μmol/L)组,MTT法检测各组细胞增殖能力,ELISA检测各组细胞分泌TNF-α/IL-6水平,PCR和Western blot检测各组细胞TLR4/NF-κB mRNA和蛋白表达。结果:分离培养的hPDLCs抗波丝蛋白表达阳性,抗角蛋白表达阴性。与对照组比,LPS处理后细胞增殖能力明显降低,细胞分泌TNF-α/IL-6水平和TLR4/NF-κB mRNA和蛋白表达明显增加;30~90μmol/L白藜芦醇预处理后,细胞增殖能力增加(P<0.05),细胞分泌TNF-α/IL-6水平、TLR4/NF-κB mRNA以及蛋白表达则下调(P<0.05),均呈现一定的浓度依赖性。结论:白藜芦醇可抑制TLR4/NF-κB活化并减轻LPS诱导的牙周膜细胞损伤。

补肾壮骨方剂含药血清调控牙周膜干细胞增殖分化的效能研究

目的探讨补肾壮骨方剂含药血清对人牙周膜细胞增殖和骨向分化的作用。方法采用酶消化法体外培养人牙周膜细胞,用不同剂量的补肾壮骨方剂含药血清处理细胞,通过四唑盐(MTT)比色试验和碱性磷酸酶活性测试,检测补肾壮骨方剂含药血清对细胞体外增殖分化的影响。结果体外实验补肾壮骨方剂含药血清对人牙周膜细胞增殖有明显促进作用,且能促进人牙周膜细胞碱性磷酸酶的活性表达。结论补肾壮骨方剂含药血清促进牙周膜细胞的增殖活性,可明显促进牙周膜细胞骨向分化。

三种组织块法培养人牙周膜细胞的比较研究

目的提高人牙周膜细胞(Human periodontal ligament cells,HPDLCs)原代培养的成功率,并缩短培养周期。方法以高血清培养基组织块法、传统组织块法和玻片覆盖组织块法等3种方法原代培养HPDLCs。通过镜下观察细胞形态,免疫组化方法鉴定细胞来源,及绘制细胞生长曲线等方面,对各种方法的成功率进行比较。结果 3种方法所培养的原代细胞均生长良好,呈梭形,波形丝蛋白和碱性磷酸酶染色阳性、角蛋白染色阴性,符合HPDLCs的形态和生物学特征。高血清培养基组织块法的原代培养的成功率为84.21%,明显高于其他2种方法 (P<0.01)。结论高血清培养基组织块法能显著提高HPDLCs原代培养的成功率。

牵张应变对人牙周膜细胞中NLRP3炎症体通路相关因子表达的影响

目的研究牵张应变对人牙周膜细胞(human periodontal ligament cells,HPDLCs)表达炎症体通路相关因子的影响。方法对体外培养的HPDLCs施加20%牵张应变6、24 h,分别采用实时定量PCR以及免疫印迹技术检测NLRP3、Caspase-1及IL-1β的mRNA及蛋白表达的变化。对体外培养的HPDLCs施加20%牵张应变1、2、4、6 h后,采用酶联免疫吸附实验检测细胞分泌的IL-1β蛋白变化。对照组HPDLCs培养于弹性培养皿中,与动态牵张应变加载组的培养条件一致,但不加载应变。结果 6 h牵张应变作用下HPDLCs中NLRP3、caspase-1及IL-1β的mRNA及蛋白表达较对照组增加(P<0.05);24 h牵张应变作用下HPDLCs中NLRP3的蛋白表达水平上调(P<0.05);加载牵张应变4、6 h后,细胞培养上清中IL-1β含量随牵张时间的增长而增加(P<0.05)。结论20%机械牵张6 h能诱导HPDLCs中NLRP3/Caspase-1炎症体-IL-1β通路因子的表达。

Leptin对人牙周膜细胞骨向分化作用的实验研究

目的探讨瘦素(leptin)对人牙周膜细胞增殖和骨向分化的作用。方法采用酶消化法体外培养人牙周膜细胞,用不同浓度梯度的leptin处理细胞,通过四唑盐(MTT)比色试验和碱性磷酸酶活性测试,检测leptin对细胞体外增殖分化的影响。将人牙周膜细胞与羟基磷灰石/磷酸三钙材料作为复合体,植入BALBc免疫缺陷裸鼠,12周后采用组织学和免疫组化法检测裸鼠体内生成物。结果体外实验leptin对人牙周膜细胞增殖有明显抑制作用,但leptin能促进人牙周膜细胞碱性磷酸酶的活性表达。体内试验中leptin可提高牙周膜细胞生成类骨质的能力。结论 leptin抑制牙周膜细胞的增殖活性,但可明显促进牙周膜细胞骨向分化。

牵张应变诱导人牙周膜细胞凋亡过程中caspase蛋白酶表达的初步研究

目的研究在牵张应变诱导人牙周膜细胞凋亡过程中caspase蛋白酶表达的变化。方法对体外培养的人牙周膜细胞分别施加20%牵张应变6、24 h,采用流式细胞术测定细胞凋亡率,采用免疫印迹技术检测caspase-3、-5、-7、-8、-9的蛋白表达,并采用分光光度比色法测定caspase-3、-5、-8、-9的蛋白酶活性变化。结果 20%牵张应变加载6、24 h可诱导人牙周膜细胞发生凋亡。caspase-3的蛋白表达及蛋白酶活性和caspase-7的蛋白表达在24 h牵张应变作用下较对照组增加,caspase-5、-8、-9的蛋白表达及蛋白酶活性在6、24 h牵张应变作用下较对照组增加。结论 20%牵张应变能诱导体外培养的人牙周膜细胞凋亡,此过程中伴随发生了caspase-3、-5、-7、-8、-9蛋白酶的活化。

烟草浸提液对人牙周膜细胞HSP70表达的影响

目的：观察烟草浸提液（ST）对人牙周膜细胞（hPDLCs）增殖、热休克蛋白70（HSP70）表达的影响。方法：常规培养hPDLCs，第5～8代细胞用于实验。对照组为常规培养液，实验组为含不同浓度的 ST 培养液（0．016～50 g/L ST），作用24 h后 MTT 法检测细胞增殖、免疫组化和 Western Blot 法检测细胞 HSP70的表达。结果：ST 浓度为0．4～50 g/L 时抑制 hPDLCs增殖，增强细胞质及胞核内 HSP70的表达；ST 浓度增加，其作用更明显。结论：ST 可抑制 hPDLCs 增殖，促进 HSP70呈表达。

补肾中药醇提活性成分对人牙周膜细胞生物学性状的影响

目的:观察补肾中药醇提活性成分对体外培养人牙周膜细胞增殖和功能的影响。方法:应用组织块法和酶消化法体外培养人牙周膜细胞,以MTT法检测补肾中药活性成分对人牙周膜细胞的增殖率和中药活性成分对ALP活性的影响。结果:补肾中药醇提活性成分对人牙周膜细胞增殖能力和ALP活性有增强作用。结论:补肾中药醇提活性成分对体外培养人牙周膜细胞的增殖和功能有促进作用。

乳铁蛋白对人牙周膜细胞增殖迁移分化的影响

目的:观察乳铁蛋白(lactoferrin,LF)对体外培养的人牙周膜细胞(HPDLCs)增殖、迁移和成骨分化的影响。方法:原代培养并鉴定人牙周膜细胞,稳定传代后用MTT比色法、Transwell法及划痕试验检测浓度分别为0、10、20μg/ml的乳铁蛋白对牙周膜细胞增殖和迁移的影响;矿化条件下,0、10、20μg/ml的乳铁蛋白作用牙周膜细胞后,茜素红染色法和实时荧光定量PCR检测矿化能力及成骨相关基因的表达。结果:10、20μg/ml乳铁蛋白均能促进HPDLCs增殖、迁移(P<0.05)。10、20μg/ml乳铁蛋白组矿化结节数量增多(P<0.05),碱性磷酸酶(ALP)、骨钙蛋白(OCN)、骨桥蛋白(OPN)表达量均有升高(P<0.05)。结论:乳铁蛋白能够促进人牙周膜细胞增殖、迁移与成骨分化。

芦荟提取物对脂多糖诱导的人牙周膜细胞炎性反应的抑制作用

目的:探讨芦荟(AVE)提取物对脂多糖(LPS)诱导人牙周膜细胞(h PDLCs)炎性反应的作用。方法:将h PDLCs分为对照组,模型组(1μg/ml LPS)和AVE组,浓度为0.05,0.1,0.2 mg/ml的AVE分别处理AVE组的h PDLCs;MTT法测定各组细胞存活率;ELISA法检测细胞上清中IL-6含量;用免疫细胞化学染色检测TLR4的表达情况;免疫荧光染色检测NF-κB-p65的核转情况。结果:各组细胞存活率差异没有显著性,模型组上清液中的IL-6含量显著升高,TLR4表达及NF-κB-p65的核转均明显上调;与模型组相比,芦荟提取物呈剂量依赖性抑制细胞上清液中IL-6的分泌,下调TLR4表达及NF-κB-p65的核转移。结论:芦荟提取物能有效抑制人牙周膜细胞的炎症反应,其机制与TLR4/NF-κB-p65信号通路有关。

牙龈卟啉单胞菌牙龈蛋白酶K对人牙周膜细胞增殖的影响

目的探讨牙龈卟啉单胞菌牙龈蛋白酶K对人牙周膜细胞增殖的影响。方法组织块法体外培养人牙周膜细胞,不同浓度的牙龈蛋白酶K作用于人牙周膜细胞24h,对照组为无牙龈蛋白酶K作用的人牙周膜细胞。浓度为12.5μg/ml牙龈蛋白酶K分别作用于人牙周膜细胞24、48、72、96h,对照组也培养相同的时间。采用MTT法检测人牙周膜细胞的增殖,比较实验组与对照组人牙周膜细胞增殖的变化,数据采用单因素方差分析及独立样本t检验。结果牙龈蛋白酶K浓度在6.25～50μg/ml时,作用24h,实验组人牙周膜细胞的增殖低于对照组;牙龈蛋白酶K浓度为12.5μg/ml,作用24～96h,实验组人牙周膜细胞的增殖低于对照组,有显著性差异。结论牙龈卟啉单胞菌牙龈蛋白酶K可抑制体外培养的人牙周膜细胞增殖,并呈剂量和时间依赖性。

美洲大蠊提取物抑制LPS诱导的人牙龈细胞与牙周膜细胞的炎症反应

目的:探讨美洲大蠊提取物( PAE)对脂多糖( LPS)诱导的人牙龈成纤维细胞( HGFs)和牙周膜细胞( HPDLCs)炎症反应的影响及潜在的作用机制。方法:分别将原代培养的HGFs 和HPDLCs 分为对照组、LPS 组( 1 μg /ml)和PAE 干预组。通过MTT、ELISA 及免疫细胞染色法检测各组细胞活性及炎症反应。结果:各组细胞存活率没有显著性差异;LPS 可显著升高HGFs和HPDLCs 的Toll 样受体4( TLR4)与基质金属蛋白酶2( MMP2)表达、核转录因子-κB-p65( NF-κB-p65)核内转及白细胞介素6( IL-6)含量;PAE 对LPS 介导的2 种人源牙周病体外细胞模型的炎症反应均有浓度依赖性的抑制作用,其中PAE 对HGFs 与HPDLCs 炎症反应的有效抑制浓度分别为2 mg /ml 与0. 2 mg /ml。结论: PAE 能有效抑制LPS 激活的HGFs 和HPDLCs 炎症反应,其机制可能与抑制TLR4 /NF-κB 信号通路有关。

生理状态下人牙周膜成纤维细胞的原子力显微镜下的观察

目的:利用原子力显微镜(AFM)观察人牙周膜细胞(h PDLCs)的表面形貌及细胞骨架。方法:用酶消化组织块法获得原代h PDLCs并经免疫组化鉴定,用弹性常数为0. 03 N/m标准原子力微悬臂进行接触模式扫描,采集细胞原子力显微镜的纳米级高分辨细胞形貌图。结果:h PDLCs波形丝蛋白阳性,角蛋白染色阴性。原子力显微镜图像显示,生理状态下h PDLCs细胞膜下有应力纤维结构。结论:h PDLCs细胞膜下具有应力纤维结构。

牵张应力对人牙周膜细胞MMP-2表达的影响及相关信号通路的研究

目的:探讨NF-κB通路对牵张应力介导的人牙周膜细胞(HPDLCs)中MMP-2表达的影响。方法:按胶原酶消化法培养HPDLCs,分为5组:非加力对照组(A组);12%形变率,3 h组(B组);12%形变率,6h组(C组);12%形变率,12 h组(D组);12%形变率+PDTC干预,12h组(E组),通过细胞牵张应力加载系统施加机械牵张应力,结束后收集细胞提取蛋白,用蛋白印迹法检测MMP-2蛋白表达的变化。结果:B、C、D组MMP-2表达大于A组,差异有统计学意义(P<0.05),且随着作用时间的延长蛋白表达增加;NF-κB通路抑制剂PDTC可抑制机械牵张应力作用下牙周膜细胞MMP-2表达的增加。结论:持续机械牵张应力可诱导人牙周膜细胞MMP-2表达的增加,从而影响牙周组织细胞外基质代谢,机械牵张应力可通过NF-κB通路影响MMP-2蛋白的表达。