FasL基因转染诱导大鼠肾移植免疫耐受的实验研究

目的:探讨Fas配体(Fasligand,FasL)在大鼠肾移植免疫耐受中的作用及意义。方法:首先建立大鼠同种肾移植模型。实验组供肾移植前用1ml含重组腺病毒Ad-FasL的肾脏冷保存液经肾动脉灌注;建立同种大鼠肾移植模型。分别观察电镜、免疫组织化学法、肾功能测定、生存期,比较各组间的不同。结果:Ad-FasL治疗组肾移植受体大鼠平均存活天数为31.3d,与对照组的平均9.1d存活时间比较,平均存活天数增加了22d,差异显著。Ad-FasL治疗组的移植肾功能基本保持稳定,对照组在术后5d切除对侧肾脏后血清肌酐浓度迅速上升。结论:腺病毒载体可成功介导FasL基因对大鼠肾脏的转染,并对移植肾起免疫保护作用、延长移植肾的存活时间。

激活型Akt1转染大鼠胰岛对移植物凋亡和再血管化的影响

目的探讨腺病毒介导激活型蛋白激酶B(Akt1)基因(Adv-CA-Akt1)转染大鼠胰岛对同种糖尿病大鼠胰岛移植物凋亡和再血管化的影响。方法分离纯化Wistar大鼠胰岛,转染Adv-CA-Akt1。36只糖尿病Wistar大鼠完全随机均分为3组:Adv-CA-Akt1组(Adv-CA-Akt1转染的胰岛移植);Adv-LacZ组(Adv-LacZ转染的胰岛移植);未转染组(单纯胰岛移植)。术后每日测血糖,隔日测血清胰岛素浓度,术后10 d行静脉糖耐量试验(IVGTT)观察胰岛功能;HE染色和胰岛素免疫组化检测胰岛功能,细胞凋亡原位检测胰岛凋亡,CD31免疫组化计数微血管密度(MVD)。结果Adv-CA-Akt1组大鼠血糖术后2 d恢复正常,Adv-LacZ组和未转染组血糖虽下降但仍高于正常;Adv-CA-Akt1组术后各时相血清胰岛素水平明显高于其他2组(P<0.05)。IVGTT示Adv-CA-Akt1组血糖下降较快,60 min恢复至空腹水平;另2组下降慢,60 min仍未恢复至空腹水平。术后3 d,Adv-CA-Akt1组肾被膜下存活胰岛细胞数量多,胰岛素免疫组化证明为有功能的胰岛。Adv-CA-Akt1组胰岛凋亡率比Adv-LacZ组和未转染组降低约25%;术后12 d,Adv-CA-Akt1组MVD比Adv-LacZ组及未转染组明显增高(P<0.05)。结论激活型Akt1转染大鼠胰岛能够抑制胰岛细胞凋亡,提高胰岛β细胞功能,促进移植物早期再血管化。

核受体相关因子1基因转染神经干细胞移植治疗帕金森病

目的探讨转染核受体相关因子1(Nurr1)基因的神经干细胞(NSCs)移植至帕金森病(PD)大鼠纹状体后向多巴胺能神经元的分化及对PD大鼠行为的影响。方法应用脑立体定位技术构建单侧PD大鼠模型。将PD大鼠随机分为3组,每组8只。假手术组注射生理盐水,NSCs组移植未转染的NSCs,Nurr1组先将重组质粒载体pEGFP-N1-Nurr1转染NSCs,用RT-PCR方法及免疫荧光染色检测Nurr1基因的表达效果,然后用转染Nurr1基因的NSCs进行移植。细胞用DIL标记后移植至PD大鼠右侧纹状体中,术后2周起用阿朴吗啡诱发旋转试验观测移植后大鼠行为改善情况,12周后用免疫荧光技术检测移植细胞中酪氨酸羟化酶(TH)的表达。结果重组质粒转染后Nurr1基因能在NSCs中过表达。移植后假手术组和NSCs组PD大鼠的旋转圈数均无下降趋势,两者差异无统计学意义(P>0.05);NSCs组移植区可见DIL阳性细胞,但TH免疫阳性细胞较少,平均每视野为(3.21±0.40)个;Nurr1组移植后PD大鼠的旋转圈数从第6周开始下降,移植区DIL/TH双标神经元每视野达(9.28±1.09)个。结论 Nurr1基因过表达能诱导NSCs在PD大鼠纹状体内分化为TH阳性的多巴胺能神经元,并在一定程度上改善大鼠的行为功能。

血红素加氧酶-1基因转染对非协调性异种心脏移植物的影响

目的观察血红素加氧酶-1(HO-1)基因转染对非协调性异种心脏移植物的影响,并探讨其可能的保护机制。方法采用颈部袖套血管吻合法联合应用中华眼镜蛇毒因子(CVF)建立稳定的豚鼠-SD大鼠非协调性异种异位心脏移植模型。供体豚鼠和受体SD大鼠各24只,每组各8只随机配对分为Ⅰ组(对照组)、Ⅱ组(空白载体组)和Ⅲ组(HO-1基因转染组),分别在供心冷缺血期间经冠状动脉缓慢灌注单纯的HTK液、含腺病毒空白载体的HTK液和含有HO-1基因的腺病毒表达载体HTK液,供心复跳后观察其存活时间;供心停跳后取心肌组织行病理学检查,RT-PCR检测目的基因的表达情况,免疫组织化学染色进行定性和定位分析。结果 RT-PCR检测证实异种移植心脏外源性HO-1基因转录;免疫组织化学染色证实目的基因表达蛋白在移植心脏血管周围心肌细胞以及冠状动脉微血管内表达。HO-1表达的移植心脏炎症细胞浸润明显减少,巨噬细胞和NK细胞浸润明显减少,心肌细胞凋亡减少,移植心脏平均存活时间[n=8,(40±3)h]与空白载体组[n=8,(21±2)h,P<0.01]和对照组[n=8,(20±3)h,P<0.01]相比明显延长。结论在供心离体期间,经冠状动脉缓慢灌注腺病毒表达载体介导HO-1基因进行基因转染,可以使保护性功能基因HO-1在移植心脏成功转录并表达其相应的功能蛋白,从而保护异种移植物减轻免疫损害,延长异种移植心脏的存活时间,为进一步的临床应用提供实验依据。

重组腺相关病毒介导的PD-L1基因在大鼠移植肝中的表达

目的探讨供肝转染PD-L1-AAV2-RFP后基因的表达情况。方法近交系BN大鼠随机分3组:同基因肝移植组(ISO组)、腺相关病毒空载体组(AAV组)、基因转染组(PD-L1组),每组6对。ISO组供肝冷保存期经门静脉注射生理盐水2mL,保存2h后采用改良"二袖套法"行原位肝移植;AAV、PD-L1组所用灌注液分别为AAV2-RFP空病毒颗粒和PD-L1-AAV2-RFP(1×1011v.g./只)。术后7、14d各取3只大鼠采血测定肝功能,取肝组织即刻行冰冻切片在荧光显微镜下观察RFP的表达,免疫组化染色法检测PD-L1蛋白的表达。结果3组术后7d谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)均明显增高,14d后基本恢复正常,各组间相比均无显著性差异(P>0.05);术后7d在荧光显微镜下AAV、PD-L1组移植肝可见少量而微弱的红色荧光,14d可见高亮度的红色荧光,而各组肝外组织及ISO组各时段均未见红色荧光;免疫组化染色结果示未转染组PD-L1蛋白均微弱表达,而PD-L1转染7d后随时间延长靶基因表达逐渐增强(P<0.05)。结论重组腺相关病毒介导,体外冷保存期经门静脉途径供肝转染PD-L1,可以使PD-L1基因在肝内获得安全、有效的表达。

经冠状动脉转染转化生长因子-β1基因对大鼠移植心脏缺血-再灌注损伤的影响

目的:探讨经冠状动脉转染重组腺病毒介导的转化生长因子-β1(TGF-β1)基因对大鼠移植心脏缺血-再灌注损伤的影响。方法:利用Cuff技术建立颈部异位心脏移植模型。转基因组供心离体灌注含5×109pfu/gm携带mTGF-β1基因腺病毒颗粒的4℃Stanford大学停跳液,空白对照组灌注4℃Stanford大学停跳液,空载体组灌注含5×109pfu/gm空白载体的4℃Stanford大学停跳液。移植术后8h切取移植心脏,电镜下观察移植物超微结构。免疫组化染色检测移植物mTGF-β1、细胞间黏附分子-1(ICAM-1)及核因子-κB(NF-κB)的表达。结果:移植后8h,与其他2组相比,转基因组心肌细胞肿胀减轻,炎性细胞浸润减少,心肌线粒体水肿明显减轻,无明显的肌丝断裂现象。空白对照组与空载体组无外源性mTGF-β1蛋白的表达,转基因组有mTGF-β1的表达。3组间相比,心肌组织ICAM-1与NF-κB的表达差异有统计学意义(F=23.8,P=0.008;F=36.7,P=0.007)。转基因组ICAM-1与NF-κB的表达较空白对照组与空载体组降低(P<0.01)。结论:经冠状动脉灌注重组腺病毒介导的TGF-β1基因能减轻移植心脏缺血-再灌注损伤,其机制可能与下调ICAM-1及NF-κB的表达有关。

大鼠胰岛细胞转染Wee1Hu基因延长异种胰岛细胞移植后存活时间

目的 探讨大鼠胰岛细胞转染Wee1Hu基因对异种胰岛细胞移植后存活时间的影响。方法 以Wistar大鼠为供者，Balb／c糖尿病小鼠为受者，进行异种胰岛细胞移植。实验分为2组，每组20只。实验组：将转染Wee1Hu基因的1×10^6个供者胰岛细胞悬于0．5ml无菌生理盐水中，注射至受者的腹腔；空白对照组：将1×10^6个空载体胰岛细胞用与实验组相同的方法注射至受者腹腔。实验组和空白对照组的部分受者在移植前1周腹腔注射降植烷0．5ml，并于胰岛细胞移植后开始口服环孢素A30mg／kg，直至实验结束。监测2组胰岛细胞移植后的胰岛素释放功能及存活时间。结果 胰岛细胞移植后，空白对照组的受者均维持高血糖，且体重持续下降，平均生存时间为（18±2．5）d；实验组的受者血糖在2d内均降至正常，且体重增加，生存时间延长（38±3．5）d；两组相比较，差异有统计学意义（P〈0．05）。空白对照组维持正常血糖时间为（8±2．3）d，而实验组为（10±2．5）d。实验组中采用免疫抑制剂治疗的受者，长期维持正常血糖，平均维持时间超过30d，与空白对照组中采用免疫抑制剂治疗的受者比较，差异有统计学意义（P〈0．05）。结论 大鼠胰岛细胞转染Wee1Hu基因可延长异种胰岛细胞移植后的存活时间，与免疫抑制剂协同作用时效果更佳。

大鼠供肾转染Fas配体基因延长移植肾存活时间

目的观察大鼠供肾转染Fas配体(FasL)基因是否能延长肾移植后受者和移植肾的存活时间,研究其对移植肾的保护作用.方法供者为SD大鼠,受者为Wistar大鼠,随机配对分为实验组和对照组.实验组供肾移植前用1ml含重组腺病毒AdV-FasL的HC-A肾脏冷保存液(0～4℃)经肾动脉灌注;对照组用1ml HC-A肾脏冷保存液(0～4℃)灌注.建立同种肾移植模型.应用逆转录聚合酶链法(RT-PCR)及免疫组织化学方法检测外源FasL基因的表达;透射电镜观察移植肾超微结构的变化;并对肾移植后大鼠的存活率及血肌酐水平进行观察.结果实验组移植肾转基因后FasL mRNA及蛋白均呈阳性表达,FasL蛋白的表达主要分布于小动脉、肾小球及近曲小管.实验组移植肾免疫排斥反应及超微结构变化均较对照组减轻.实验组及对照组肾移植后大鼠的存活时间中位数分别为32.2 d和12.1 d;术后第7 d,实验组血肌酐水平为(315.2±19.2)μmol/L,对照组为(416.2±48.6)μmol/L;两组相比,差异有统计学意义(P＜0.05).结论腺病毒载体可成功介导FasL基因对大鼠肾脏的转移,并对移植肾起免疫保护作用、延长移植肾的存活时间.