IMP-4型金属β内酰胺酶合并膜孔蛋白OmpK36缺失引起肺炎克雷伯菌对碳青霉烯类抗生素高水平耐药

目的 研究临床分离的肺炎克雷伯菌Z4和Z5对碳青霉烯类抗生素耐药的分子机制.方法 2008年从卫生部北京医院的急诊室和神经内科患者的痰标本分别分离到2株对碳青霉烯类抗生素不敏感的肺炎克雷伯菌Z4和Z5.测定菌株MIC,对菌株进行质粒接合试验、质粒消除试验、β内酰胺酶IEF分析、PCR扩增和DNA序列分析以及外膜蛋白分析.结果 亚胺培南、美罗培南和厄他培南对Z4和Z5的MIC分别为32、32和256μg/ml以及1、1和2μg/ml.接合试验可使受体菌大肠埃希菌对碳青霉烯的MIC值从≤0.062 5或0.125μg/ml上升到1或2μg/ml.PCR扩增和序列分析发现Z4产IMP-4型金属β内酰胺酶、TEM-1型和SHV-1型广谱β内酰胺酶 Z5产IMP-4、TEM-1和SHV-12型超广谱β内酰胺酶 2株细菌的转移接合子均只产IMP-4.质粒消除试验发现Z5的IMP-4质粒消除株（TEM-1和SHV-12阳性）对碳青霉烯类抗生素敏感,而Z4的IMP-4质粒消除株（SHV-1阳性）对碳青霉烯类抗生素敏感性降低（亚胺培南、美罗培南和厄他培南MIC分别为0.25、0.5和4μg/ml）.Z4和Z5的blaIMP-4基因均位于大小约55 000 bp质粒的I类整合子上.外膜蛋白的SDS-PAGE和ompK35/36基因序列分析发现Z4由于ompK36基因中存在点突变（CAG突变为TAG）造成基因表达提前终止而导致OmpK36膜孔蛋白缺失.结论 质粒介导的IMP-4型金属β内酰胺酶的产生或β内酰胺酶的产生合并OmpK36膜孔蛋白缺失均可引起肺炎克雷伯菌对碳青霉烯类抗生素敏感性降低,IMP-4合并OmpK36膜孔蛋白缺失则可导致肺炎克雷伯菌对碳青霉烯类抗生素高水平耐药.

β-内酰胺酶合并OmpK36膜孔蛋白缺失引起肺炎克雷伯菌对碳青霉烯类抗生素敏感性的降低

目的研究肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae，Kp）对碳青霉烯类抗生素敏感性降低的分子机制。方法临床分离到2株碳青霉烯敏感性降低的Kp Z2554和Z2110，经脉冲场凝胶电泳（PFGE）证实非同一克隆株。对2株细菌进行药物最低抑菌浓度测定（MIC）、接合试验、质粒图谱分析、等电聚焦电泳（IEF）、特异性PCR扩增和DNA序列分析、外膜蛋白分析以及羰酰氰氯苯腙（CCCP）抑制试验等。结果Kp Z2554和Z2110对亚胺培南和美罗培南的MIC为1～8μg／ml，前者对青霉素类、头孢菌素类和氨曲南等抗生素高度耐药，后者对上述抗生素的耐药程度稍弱于前者，但对头孢西丁的MIC大于512μg／ml。IEF、PCR扩增和DNA序列分析证实Kp Z2554产TEM-1（等电点5．4）和CTX-M-14（等电点7．9）2种β-内酰胺酶，Kp Z2110产TEM-1、CTX-M-14和DHA-1（等电点7．8）3种酶。SDS-PAGE分析显示2株细菌均有相对分子质量（Mr）为39×10^3蛋白条带（OmpK36）的缺失。外膜蛋白基因（ompK35和ompK36）序列分析发现，Kp Z2554和Z2110的ompK35基因的个别位点存在点突变，但氨基酸序列不变。CCCP抑制试验显示CCCP不能提高Kp Z2554和Z2110对碳青霉烯类抗生素的敏感性。结论β-内酰胺酶的产生合并OmpK36膜孔蛋白的缺失可引起蜘对碳青霉烯类抗生素敏感性的降低。

烧伤患者产NDM-1型金属β-内酰胺酶肺炎克雷伯菌的碳青霉烯类抗生素耐药机制研究

目的探讨烧伤患者感染肺炎克雷伯菌对碳青霉烯类抗生素高水平耐药的分子机制。方法采用回顾性分析方法，收集南昌大学第一附属医院2014年7月至2015年6月烧伤患者分离的非重复碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌（CR－KP）18株。测定菌株最低抑菌浓度（MIC），对菌株进行特异性PCR扩增和序列分析、质粒接合试验、Southern杂交以及外膜蛋白分析。多位点序列分型（MLST）分型技术和脉冲场凝胶电泳（PFGE）分析菌株同源性。结果药敏试验显示所有碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌（CR－KP）具有多重耐药，对哌拉西林/他唑巴坦、头孢曲松、左氧氟沙星、环丙沙星、庆大霉素、妥布霉素、头孢替坦、头孢他啶、头孢吡肟、氨曲南、亚胺培南、美罗培南全部耐药，耐药率100%（18/18）；对替加环素、复方新诺明、阿米卡星对耐药率分别为0%（0/18）、61.1%（11/18）、72.2%（13/18）。接合试验可使受体菌大肠埃希菌J53对碳青霉烯的MIC值从≤0.0625或0.125 μg/ml上升到16或32 μg/ml。特异性PCR扩增和序列分析发现18株产NDM－1菌株，5株KPC－2菌株。接合试验证实blaNDM－1可以通过质粒传播。Southern杂交显示blaNDM－1基因定位于46Kb大小的质粒上，质粒复制子分型显示为IncX3型。PFGE共7种细菌基因型，而MIST分型发现18株CR－KP分别属于ST11、ST395、ST17、ST37、ST263、ST14和ST76型。外膜蛋白的SDS－PAGE和ompK35/36基因序列分析发现ST11、ST395和ST37型CR－KP菌株OmpK36膜孔蛋白缺失，而其他ST分型菌株OmpK36膜孔蛋白表达量降低。结论本院烧伤患者分离的肺炎克雷伯菌对碳青酶烯类药物高水平耐药的主要机制是质粒介导的NDM－1型金属β－内酰胺酶的产生合并OmpK36膜孔蛋白表达降低或缺失，并且发现了同时携带NDM－1和KPC－2种碳青霉烯酶的肺炎克雷伯菌。