甘蔗内生固氮菌Klebsiella variicola DX120E溶磷基因GDH和pqqE的克隆及溶磷特性分析

葡萄糖脱氢酶(GDH)和吡咯喹啉醌(PQQ)对溶磷微生物溶解无机磷具有重要作用。本研究为了探讨甘蔗内生固氮菌变栖克雷伯菌(Klebsiella variicola)DX120E的溶磷机制,从该菌中克隆溶磷基因GDH和pqqE的ORF,并进行了生物信息学分析,同时还研究了该菌对不同磷源的利用能力。结果表明:克隆得到甘蔗内生固氮菌Klebsiella variicola DX120E GDH和pqqE基因的ORF分别为2373 bp和1143 bp,编码氨基酸分别为790个和380个。生物信息学分析结果表明,GDH蛋白为稳定蛋白,pqqE蛋白为不稳定蛋白。GDH蛋白是一个与细胞信号传导有关的膜受体蛋白,具有PQQ_membr_DH、PQQ_mGDH功能域和PQQ_DH_like超家族蛋白结构;pqqE基因编码的蛋白是胞内蛋白,含有1个PQQ_syn_pqqE功能域和Radical SAM超家族蛋白的结构。内生固氮菌Klebsiella variicola DX120E对不同磷源的利用和GDH和pqqE基因在不同磷源培养时的qRT-PCR分析表明,该菌对不同磷源的溶磷能力表现为FePO_(4)>AlPO_(4)>Ca_(3)(PO_(4))_(2),且溶解FePO_(4)的能力与溶解Ca_(3)(PO_(4))_(2)、AlPO_(4)等难溶磷源的差异均显著(P<0.05)。在几种磷源条件下,GDH和pqqE基因相对表达量均增加,且2个基因的表达量变化趋势一致。GDH和pqqE基因在以FePO_(4)为磷源条件下的表达量与以Ca_(3)(PO_(4))_(2)为磷源的表达量差异显著(P<0.05)。本研究可为进一步研究内生固氮菌与甘蔗的互作和溶磷机制提供参考。

甘蔗内生固氮菌Klebsiella variicola DX120E nifH基因的克隆与序列分析(英文)

【目的】了解甘蔗内生固氮菌变栖克雷伯氏菌（Klebsiella variicola）DX120E nif H基因的生物信息学,为揭示甘蔗内生固氮菌DX120E的固氮分子机理提供理论依据。【方法】根据NCBI上其他固氮菌株的nif H序列设计引物,对内生固氮菌Klebsiella variicola DX120E菌进行PCR扩增;运用生物信息学方法对其核苷酸序列、编码的氨基酸序列进行分析,并对其蛋白结构进行预测。【结果】甘蔗内生固氮菌Klebsiella variicola DX120E nif H基因的ORF为882bp,Gen Bank登录号为KF732646.1,与Klebsiella pneumoniae 342、Klebsiella variicola At-22等6种固氮菌的nif H基因氨基酸序列同源性高达95.0%-99.0%。DX120E nifH蛋白与Klebsiella pneumoniae 342的亲缘关系最近,与非克雷伯氏菌固氮菌的亲缘关系较远。生物信息学分析显示,菌株DX120E的nif H基因编码293个氨基酸,起特别重要的氨基酸残基非常保守。该基因在N端有11个氨基酸残基即酪氨酸—甘氨酸—赖氨酸—甘氨酸—甘氨酸—异亮氨酸—甘氨酸—赖氨酸—丝氨酸—苏氨酸—苏氨酸,其属于典型结合ATP的基序结构。nif H蛋白分子量为32.07k D,pI为4.92,为酸性蛋白;其具有2个ASN糖基化位点,1个CAMP磷酸化位点,6个CK2磷酸化位点,6个PKC磷酸化位点。疏水性预测显示该蛋白为亲水性蛋白,无信号肽。【结论】变栖克雷伯氏菌（Klebsiella variicola）DX120E nif H基因的推导氨基酸序列与克雷伯氏菌固氮菌属具有较高的同源性,该基因在甘蔗生物固氮过程中可能起重要作用。

甘蔗内生固氮菌Klebsiella variicola DX120E nifD基因的克隆、原核表达及纯化

基于NCBI数据库中固氮菌nif D基因的核苷酸序列,设计并合成特异性引物,以甘蔗内生固氮菌Klebsiella variicola DX120E为模板,通过PCR方法获得了Klebsiella variicola DX120E nif D基因的ORF;以p ET30a(+)为原核表达载体,构建重组表达质粒p ET30a-nif D。将正确的重组质粒转入原核表达菌株BL21(DE3),在28℃培养条件下经1 mmol/L的异丙基硫代半乳糖苷(isopro-ply-β-D-thiogalactopyranoside,IPTG)诱导表达;通过SDS-PAGE电泳检测融合蛋白表达情况。结果表明,本研究克隆得到甘蔗内生固氮菌Klebsiella variicola DX120E nif D基因的ORF为1 452 bp,编码483个氨基酸;原核诱导表达后经提纯和质谱鉴定,该蛋白等电点为5.90,分子量为53.87 k D,与预期大小一致。该蛋白在原核表达系统中以包涵体的形式成功表达。利用Ni柱亲和层析方法进一步获得了纯度较高的重组蛋白,为今后单克隆抗体的制备、蛋白质印记杂交检测(Western Bloting)等研究奠定了基础。

接种变栖克雷伯氏菌DX120E对不同甘蔗品种的促生效应

为探究具有高固氮酶活性的变栖克雷伯氏菌DX120E回接甘蔗后的固氮能力和促生效应,以甘蔗品种B8和GT21的无菌组培苗为材料,采用根部接种的方法,研究固氮菌DX120E在甘蔗体内的定殖数量及其对甘蔗组培苗植株生长、氮代谢关键酶活性和硝态氮含量及矿质元素吸收的影响.结果表明:固氮菌DX120E能在甘蔗根和地上部分组织内生存和定殖;接种固氮菌DX120E可以有效促进甘蔗植株生长和对矿质营养的吸收;显著提高甘蔗植株体内的硝酸还原酶(NR)活性,同时也能在一定程度上提高植株体内谷氨酰胺合成酶(GS)活性,增加硝态氮含量.表明变栖克雷伯氏菌DX120E对甘蔗具有明显的促生效应,在生物固氮肥开发方面具有较大的应用前景.