Klenow(exo-)蛋白的制备及其在RAA检测体系中的应用研究

为了建立一种Klenow(exo-)蛋白的制备方法,并对其在RAA(recombinase-aid amplification)技术中的应用进行初步研究,通过Overlap点突变法构建获得目的基因片段,并构建Klenow(exo-)蛋白表达载体进而转化至大肠杆菌BL21(DE3)菌株进行诱导表达。表达产物通过Ni-NTA螯合层析进行初步纯化,然后用Heparine柱层析进一步纯化,通过SDS-PAGE鉴定纯化产物,获得了纯度较高的目的蛋白。用纯化后的目的蛋白配制RAA反应体系,针对肉源实际样本设计突变位点进行检测。实验结果显示该体系具有较强的特异性,在模板基因序列3′端出现双碱基差异时不会进行有效扩增,相较于常规的PCR检测方式该体系能够实现双碱基差异位点的有效区分。该技术未来有望大规模应用于SNPs的检测。