超声应变技术评估PCSK9基因敲除对肥胖小鼠心肌功能的影响

目的应用超声应变技术评估PCSK9基因敲除对肥胖小鼠心肌功能的影响,并探讨其机制。材料与方法选取6周龄野生型C57BL/6雄性小鼠20只,随机分为正常组和肥胖组,各10只;选取6周龄PCSK9^(-/-)C57BL/6雄性小鼠10只为PCSK9^(-/-)组。肥胖组和PCSK9^(-/-)组给予高脂饲料造模,正常组给予普通饲料,12周后从肥胖组和PCSK9^(-/-)组中选取造模成功小鼠,3组小鼠行心脏超声、透射电镜及免疫荧光染色进行观察。结果肥胖组、正常组和PCSK9^(-/-)组小鼠室间隔舒张末期厚度分别为(0.98±0.13)mm、(0.77±0.07)mm、(0.78±0.13)mm,差异有统计学意义(F=5.10,P=0.02),肥胖组较正常组增厚(t=2.73,P<0.05),PCSK9^(-/-)组较肥胖组变薄(t=-2.92,P<0.05)。3组左心室整体纵向应变及整体圆周应变差异有统计学意义(F=7.44、15.40,P<0.05),其中肥胖组较正常组整体纵向应变和整体圆周应变减低(t=3.79、5.50,P<0.05),PCSK9^(-/-)组较肥胖组整体纵向应变和整体圆周应变升高(t=-2.53、-3.37,P<0.05)。电镜及免疫荧光结果显示,肥胖组心肌超微结构受损,NLRP3及Caspase-1表达较正常组增多(t=12.53、-4.73,P<0.05),PCSK9^(-/-)组心肌超微结构受损明显改善,NLRP3及Caspase-1表达较肥胖组减少(t=-6.23、2.05,P<0.05)。结论超声应变技术较常规心脏超声参数能更敏感地发现PCSK9基因敲除肥胖小鼠心肌功能的改变;PCSK9基因敲除后可能通过抑制NLRP3及Caspase-1表达改善肥胖小鼠心肌功能。

Instability of microsatellites linked to targeted genes inCRISPR/Cas9-edited and traditional gene knockout mouse strains

The classic method for gene knockout (KO) is based on homologous recombination (HR) and embryonic stem cell technique (Gerlai,1996).Actually,the procedure of homologous replacement is complicated and time consuming,although it has been popular during the past decades.Recent years,genome editing which can cause DNA sequence-specific mutations in the genomes of cellular

猪链球菌2型次黄嘌呤核苷酸脱氢酶缺失株的构建

【目的】猪链球菌2型(Streptococcus suis type2,SS2)为一种重要的人兽共患病病原,次黄嘌呤核苷酸脱氢酶(IMPDH)为SS2新近鉴定的一个蛋白,本文旨在体外构建基因缺失株明确IMPDH与SS2致病力的相关性。【方法】选用自杀性质粒,通过体外构建具有同源臂的重组自杀性质粒,电转化进入SS2,经同源重组,获得impdh基因缺失株。通过接种不同敏感动物,明确缺失株致病力的变化。【结果】经过PCR鉴定,impdh基因被氯霉素(cat)选择标记基因表达盒所代替,Western blot鉴定结果显示,IMPDH单抗没有检测到相应的IMPDH蛋白。SS2-H(△IMPDH)对6种糖的发酵能力降低、生长速度减慢、产酸减少一个pH滴度和对本动物和试验动物的致病力减低。SS2-H(△IMPDH))对于Balb/c小鼠LD50是8.3×108CFU,而SS2-H的LD50是3.36×108CFU;对新西兰家兔只引发体温升高(高于正常体温至少1℃),不致死;对于断奶仔猪,只表现临床症状,但不引起死亡。【结论】本研究成功获得IMPDH缺失株,即SS2-H(△IMPDH),并且明确IMPDH的缺失导致了SS2对仔猪、家兔和Balb/c小鼠的致病力降低。

凝血因子Ⅸ基因剔除小鼠近交系的建立

目的 :建立可稳定遗传、临床症状显著的凝血因子 (F )基因剔除小鼠近交系。 方法 :以 PCR扩增检测小鼠尾组织 DNA,一期法检定小鼠血浆 F 活性和血浆凝血酶原时间 (PT)、白陶土部分凝血活酶时间 (KPTT)值 ;取以上结果为全阳性的小鼠以选优法进行全同胞兄妹交配 ,每代选用第一胎小鼠留种 ,第 8代开始筛选纯合子。 结果 :F8代 F 基因剔除小鼠PCR检测阳性率 92 % ,到 F1 2 代小鼠阳性率达 10 0 % ;F 活性 (2 .4 7± 1.75 ) %较正常小鼠 (14 8.18± 4 6 .98) %明显降低 (P<0 .0 1) ;F 基因剔除小鼠已近交培育到第 12代 ,遗传性状稳定 ,并有自发出血倾向。结论 :成功建立了纯合子 F 基因剔除小鼠近交系 ,该小鼠符合人血友病

肠出血性大肠杆菌O157:H7△hly△stx△toxB基因缺失株的构建

肠出血性大肠杆菌(Enterohemorrhagic Escherichia coli)O157:H7是食源感染的人兽共患病原菌。志贺毒素(Shiga toxin,Stx)、溶血素(haemolysin,Hly)和ToxB是O157:H7重要的毒力因子。选用自杀性质粒pMEG375,体外构建具有同源臂的重组自杀性质粒,借助于sm10宿主菌获得O157:H7杂交菌株,通过同源重组,依次获得O157:H7(△hly△stx△toxB)基因缺失株,△hly△stx△toxB接种HEp-2细胞和感染链霉素处理的Balb/c小鼠,明确缺失株粘附定植的能力。经PCR鉴定,hly、stx和toxB基因分别被壮观霉素(Spc+)、庆大霉素(Gm+)和卡那霉素(Kan+)基因表达盒所代替,Western blot鉴定结果显示,O157:H7(△hly△stx△toxB)检测不到相应的Stx、Hly和ToxB蛋白。O157:H7(△hly△stx△toxB)生长特性与亲本株无明显差异。对于HEp-2细胞的粘附能力明显降低。Balb/c小鼠排菌时间和排菌量明显减少和降低。本研究成功获得O157:H7(△hly△stx△toxB),并且明确Stx、Hly和ToxB的缺失导致了O157:H7对HEp-2细胞和Balb/c小鼠的粘附和定植能力降低。本研究旨在为研制EHEC O157:H7基因缺失疫苗奠定物质基础。

双元载体提供组蛋白H3/H4拷贝1的elp3Δ菌株的构建

人Elongator是在转录中有功能的组蛋白乙酰转移酶(HAT)复合物,为研究其催化亚基Elp3功能,构建了酵母组蛋白H3/H4拷贝1的双元表达载体pRS316CFT,通过PCR介导的基因敲除,获酵母基因组H3/H4缺失由双元载体提供单拷贝H3/H4的elp3Δ菌株.敏感性实验表明该载体提供H3/H4可维持酵母正常生长.本工作为构建H3/H4乙酰化位点突变菌株,用功能互补在体内研究人Elp3 HAT活性功能奠定了基础.

单增李斯特菌vip基因缺失菌株的构建与筛选

单增李斯特菌(Listeria monocytogenes)是广泛存在于自然界及食物中的食源性致病菌,作为胞内寄生菌,它可以引起强烈的细胞免疫,是潜在的优良疫苗载体。vip是单增李斯特菌的毒力基因,与其侵袭能力密切相关。因此构建vip基因敲除株可为单增李斯特菌疫苗载体的研发打下重要基础。从单增李斯特菌EGDe基因组中扩增出vip基因上、下游序列,连接到穿梭载体p KSV7中得到敲除载体p KSV7-Δvip,将其以电穿孔的方式转入单增李斯特菌后,通过同源重组利用氯霉素和温度双重压力筛选得到vip基因的敲除突变株,并对敲除菌株的生长曲线进行分析发现vip敲除对细菌的生长没有显著影响,为进一步研究vip基因功能、单增李斯特的致病机制和疫苗载体的研发提供参考。

肠出血性大肠杆菌O157∶H7 toxB基因缺失株的构建

为了明确肠出血性大肠杆菌(Enterohemorrhagic Escherichia coli)O157∶H7大质粒pO157编码的蛋白质ToxB与O157∶H7在肠道黏附、定殖的关系,构建含有toxB基因同源臂的重组自杀性质粒pMEG375-BN-Kan-BC,转化SM10宿主菌获得重组SM10(pMEG375-BN-Kan-BC)。将SM10(pMEG375-BN-Kan-BC)与O157∶H7进行混合培养,通过同源重组,获得杂交toxB基因缺失株。用体外接种的HEp-2细胞和体内感染链霉素处理的小鼠,明确缺失株黏附定殖能力。经PCR和Western blot鉴定,toxB基因被卡那霉素(Kan+)选择标记基因表达盒所代替。O157∶H7(△toxB)生长特性与亲本株相比无明显差异。O157∶H7(△toxB)与亲本株相比,对HEp-2细胞的黏附能力降低了2倍。口服感染小鼠后,O157∶H7(△toxB)第3 d粪便排菌量仅为3.1×105 CFU,持续排菌11 d;而亲本株排菌量高达4.03×107 CFU,持续排菌时间超过14 d。

斑马鱼adgrf3a基因敲除品系的构建

adgrf3a基因编码的ADGRF3A蛋白是黏附类G蛋白偶联受体(aGPCRs)家族的一员,主要在受精后5 d的胚胎以及成年斑马鱼的头部和性腺中表达。它含有一个GPS蛋白水解位点和7个跨膜结构域,与G蛋白相互作用行使其功能。斑马鱼是研究早期发育和成体内生理和病理的重要模式生物。为了研究adgrf3a在斑马鱼早期发育中的作用,我们利用CRISPR-Cas9技术构建了adgrf3a基因敲除斑马鱼品系。首先,通过分析软件筛选出该基因的敲除位点,利用聚合酶链式反应扩增该基因的向导DNA(sgDNA),再以sgDNA为模板进行体外转录得到向导RNA(sgRNA)并纯化回收,将纯化后的sgRNA和Cas9蛋白共同注射到斑马鱼1细胞期胚胎中,得到F0代嵌合体。随后,对斑马鱼胚胎进行基因编辑的有效性检测,结果表明,注射的胚胎出现了碱基缺失的现象,即sgRNA有效,将剩余胚胎培养至成鱼。将嵌合体与野生型斑马鱼杂交所得的F1代斑马鱼进行基因型鉴定,筛选adgrf3a突变杂合子,并对其adgrf3a突变位点进行Sanger测序,建立能够稳定遗传的adgrf3a基因杂合突变品系。之后,adgrf3a突变杂合子斑马鱼自交,获得adgrf3a纯合子突变斑马鱼。体视显微镜观察其成像发现,adgrf3a突变纯合子斑马鱼与野生型整体上未出现明显差异,然而,体内组织与器官的发育是否发生变化需要进一步验证。该基因敲除品系的建立为研究adgrf3a在早期发育及病理过程中的作用奠定了基础。

基于CRISPR/Cas9技术的弓形虫rop16_(I/III)缺陷虫株的构建及毒力鉴定

目的构建并鉴定弓形虫RH株rop16_(I/III)缺陷虫株。方法利用CRISPR-Cas9技术进行构建基因缺陷虫株。运用E-CRISPR数据库设计gRNA,并使用定点突变试剂盒突变pSAG1::Cas9-U6::sgUPRT质粒上的gRNA,构建pSAG1::Cas9-U6::sgrop16质粒。此外将rop16上游序列、乙胺嘧啶抗性基因、rop16下游序列3个片段连接成donorDNA,克隆于pUC19质粒上,PCR扩增donor DNA片段。pSAG1::Cas9-U6::sgrop16质粒和donor DNA片段电穿孔转染弓形虫,电转后悬液接种于HFF-1细胞中,3μmol/L乙胺嘧啶筛选电转后的虫株。PCR和Western blotting鉴定克隆化筛选虫株。吉姆萨染色分别比较RH株和RHΔrop16株对HFF-1细胞的增殖与入侵。并比较RH株和RHΔrop16株分别感染昆明小鼠后小鼠的生存和死亡率。结果经测序比对,成功构建了pSAG1::Cas9-U6::sgrop16质粒和pUC19-donorDNA质粒。PCR鉴定结果显示,DHFR编码(编码乙胺嘧啶抗性基因)序列成功插入至靶点位置,Western blotting分析结果未见RHΔrop16株有Rop16_(I/III)蛋白表达。吉姆萨染色后计数结果表明,RH株感染的细胞内每个纳虫泡内速殖子的平均数显著高于RHΔrop16虫株。毒力试验结果显示,RH株感染的小鼠在第7d即出现死亡,而rop16_(I/III)缺陷株在第9d出现死亡,但两种弓形虫株感染动物在第10d均全部死亡,两组间无统计学差异。结论利用CRISPR-Cas9技术成功构建了rop16_(I/III)缺陷的弓形虫RH虫株,rop16_(I/III)基因敲除对弓形虫RH株毒力无明显影响。

溶藻弧菌T3SS exsD基因敲除突变株构建及其表型特征

【目的】构建溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)Ⅲ型分泌系统(Type Ⅲ secretion system,T3SS)中的调控蛋白操纵子ExsD基因缺失株,研究exsD缺失株表型特征。【方法】采用overlapPCR技术构建缺失株ΔexsD,PCR检测缺失株ΔexsD的遗传稳定性,比较缺失株与野生株之间的生长速度、泳动能力、胞外酶活性、药物敏感性、毒力,分别采用结晶紫和共聚焦电镜方法测定生物膜的差异变化,通过qRT-PCR方法分析exsD的缺失对T3SS效应蛋白Hop转录的影响。【结果】缺失株ΔexsD构建成功;与野生株相比,ΔexsD遗传稳定性和生长速度无显著差别,但泳动能力极显著上升(P <0.01),胞外蛋白酶活性显著上升(P <0.05),形成生物膜能力在24 h时提高(P <0.05);相比野生株,ΔexsD对米诺环素、庆大霉素、卡那霉素、多西环素、新霉素的敏感性从耐药变成中度敏感;ΔexsD缺失株的毒力显著上升,野生株对斑马鱼的半数致死剂量是缺失株的3.68倍。实时荧光定量结果显示,与HY9901野生型相比,exsD基因的缺失增加了效应蛋白Hop的转录表达。【结论】exsD基因对T3SS的致病性起负调控作用,为进一步阐明exsD基因在溶藻弧菌中的作用机理提供一定的理论基础。

小链霉菌HCCB10043敲除硫酯酶基因的工程菌株构建及其代谢产物的研究

小链霉菌(Streptomyces parvus)HCCB10043的主要代谢产物为脂肽类化合物A21978C,其基因组序列中包括了非核糖体肽合成酶(NRPS non ribosomal peptide synthetase)、聚酮合酶(PKS polyketide synthases)以及NRPS-PKS混合的多酶体系基因簇,它们的共同特点是在代谢产物生物合成簇中连接有一个硫酯酶域,即TE(thioesterase)domain.硫酯酶可以使已经合成的化合物链的合成过程终止,并且具有水解释放成熟脂肽以及环化线性脂肽链的功能.通过对联二吡啶类代谢产物合成簇中TE基因的敲除构得工程菌株,工程菌发酵结果表明联二吡啶类代谢产物产量减少.

Komagataeibacter rhaeticus 3-15全基因组及葡萄糖脱氢酶基因缺失体的构建

细菌纤维素(BC)是一种新型的可再生、可降解的生物高分子材料。为了最大程度的发挥BC生产菌株K.rhaeticus 315的生产能力,本文首先对K.rhaeticus 315进行全基因组测序,通过功能基因的注释、分析碳源代谢流向。结果显示,该菌株碳代谢特征之一是缺乏磷酸果糖激酶的编码基因,不能通过EMP途径代谢糖类碳源,而是主要通过PPP途径和TCA途径代谢碳源,维持菌体生长和BC合成。由于葡萄糖脱氢酶的存在,该菌株在合成BC的同时生成大量副产物—葡萄糖酸。为此,本文通过敲除葡萄糖酸合成酶相关基因,即葡萄糖脱氢酶基因gcd,构建葡萄糖脱氢酶基因缺失重组株(gcd^-),将葡萄糖酸的生成量降低了77%。

庆大霉素生物合成基因genN的研究

利用生物信息学方法分析庆大霉素生物合成特色基因gen N的功能,构建gen N缺失的基因工程菌。首先运用分子生物学技术构建同源重组质粒p FU604,其次重组质粒经接合转移导入绛红色小单孢菌M.purpurea GK1101。最后,基于同源重组机制,利用安普霉素抗性筛选及PCR鉴定,得到gen N基因缺失的工程菌(M.purpurea GKN-27)。结果显示:较岀发菌GK1101,基因工程菌GKN-27不再继续合成庆大霉素C1a和C2b,阻断庆大霉素生物合成代谢流,并积累分子量为497、524、523、503四种新的中间代谢物,新的中间代谢物将有望开发新型药物。同时,也表明gen N不是C-6'N甲基化酶编码基因。

金黄色葡萄球菌β-溶血素基因缺失突变菌株构建的研究

目的:研究金黄色葡萄球菌(金葡菌)β-溶血素基因(hlb)缺失突变菌株的构建。方法:提取金葡菌COL基因组DNA,采用PCR扩增hlb基因上下游片段,构建同源重组序列;将卡那霉素抗性基因(kan)与同源重组序列连接,构建含有kan基因的同源重组序列;利用卡那霉素和氯霉素筛选获得已同源重组菌株和PCR、RTPCR和Western blot方法鉴定突变菌株中hlb基因的表达。结果:基因组PCR结果显示,突变菌株COL^(hlb)的基因组缺失hlb基因,以及进一步的RT-PCR和Western Blot结果均表明COL^(hlb)菌株不表达hlb。结论:金葡菌hlb基因敲除菌株COL^(hlb)构建成功,为β-溶血素参与金葡菌致病过程的机制研究奠定基础。

CD163基因敲除大白猪的抗蓝耳病性能和主要生产性能研究

[目的]运用CRISPR/Cas9基因编辑技术和体细胞核移植技术获得CD163基因全敲除(CD163 gene knockout,CD163-KO)的克隆猪,验证该基因敲除大白猪的抗蓝耳病特性,并研究其与野生型大白猪在生理、生产和繁殖性能等方面的差别,评估CD163-KO大白猪的主要生产性能。[方法]用猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)流行毒株NADC30-like对本研究所获得的11头CD163-KO大白猪和5头年龄、体质量相当的野生型大白猪进行攻毒试验。连续14 d观察猪的临床症状,记录直肠温度变化,检测血清中PRRSV病毒含量和抗体水平。14 d后取肺部组织进行切片,通过PRRSV免疫荧光试验观察肺脏感染情况。采集CD163-KO和野生型大白猪肺泡巨噬细胞进行免疫染色,观察肺泡巨噬细胞表面CD163蛋白的表达情况;采集猪外周血单核细胞进行诱导分化,观察CD163-KO与野生型大白猪诱导分化的巨噬细胞对血红蛋白-结合珠蛋白复合物的摄取情况。最后,统计分析CD163-KO与野生型大白猪的生产性能及公猪的繁殖性能。[结果]本研究获得的CD163-KO大白猪对蓝耳病NADC30-like毒株具有完全抗性,敲除CD163基因不影响巨噬细胞的生理功能,CD163-KO与野生型大白猪的生长性能和繁殖性能无明显差异。[结论]本研究是对CD163-KO猪抵抗蓝耳病的又一佐证和补充,证明CD163基因敲除操作对生产性能没有潜在的负面影响,为抗蓝耳病猪的生物安全提供了支撑。

不同筛选标记法构建白念珠菌RAS1基因敲除株的比较

目的采用两种筛选标记法(HIS-LEU-ARG基因敲除策略和URA-Blaster法)分别构建白念珠菌RAS1基因敲除株,并对两种方法的成功率进行比较。方法 HIS-LEU-ARG基因敲除策略中,以SN152菌株基因组DNA、筛选标记DNA为模板,采用融合PCR技术构建融合基因片段。URA-Blaster法中,以CAI4基因组DNA、hisG-URA3-hisG基因敲除盒为模板,运用无缝克隆技术构建RAS1基因敲除质粒。随后,分别将上述两种方法得到的融合基因片段和质粒线性化产物转染至白念珠菌SN152、CAI4细胞内,在营养缺陷培养基上获得阳性转化子,通过2次同源重组敲除RAS1两条等位基因。结果采用HISLEU-ARG基因敲除策略成功构建RAS1双等位基因敲除株。而采用URA-Blaster方法,重复多次均未能成功构建白念珠菌RAS1双等位基因敲除株。结论 HIS-LEU-ARG基因敲除策略比URA-Blaster法更适用于RAS1基因敲除株的构建。

罗非鱼无乳链球菌ΔessA、ΔessB、ΔessC敲除菌株的构建及其特性分析

Ⅶ型分泌系统存在于无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)中,其组成膜蛋白对底物蛋白的分泌转运至关重要。为此利用热敏型自杀质粒,构建了含氯霉素筛选标签的膜蛋白重组敲除载体pSET4s-ΔessA、pSET4s-ΔessB、pSET4s-ΔessC,经同源重组后,利用PCR技术筛选到了其缺失突变株-无乳链球菌ΔessA、ΔessB、ΔessC。通过菌株生长曲线分析,ΔessA、ΔessB、ΔessC敲除株均较野生株(WT)生长过程变慢,其中ΔessA、ΔessB敲除株在生长早期有显著性差异(P<0.01)。对ESAT6蛋白分泌影响分析显示,与WT株相比,ΔessA、ΔessB、ΔessC敲除株ESAT6的表达量均显著下调(P<0.01)。结果显示,ΔessA、ΔessB、ΔessC敲除株均较WT株毒力显著降低(P<0.01)。研究表明,essA、essB、essC为无乳链球菌Ⅶ型分泌系统重要的膜蛋白,其基因缺失造成了分泌蛋白ESAT6 mRNA表达水平下降,影响了菌株毒力。

大肠杆菌ydiB基因敲除和过表达对氨基糖苷类抗生素的耐受性分析

为了寻找新靶点解决抗生素滥用所造成的细菌耐药问题,通过比较氨基糖苷类抗生素(庆大霉素、妥布霉素、链霉素、阿米卡星、新霉素)、喹诺酮类抗生素(氧氟沙星、环丙沙星)和β-内酰胺类抗生素(氨苄西林、羧苄西林)对大肠杆菌野生型BW25113(WT)和ydiB基因敲除菌株(△ydiB)杀菌表型的差异,并且通过进一步测试以庆大霉素为代表的氨基糖苷类抗生素对过表达菌株BW25113-pCA24N和BW25113-pCA24N(ydiB)的杀菌表型,以此来确认ydiB基因对细菌耐药的重要性。结果表明:与大肠杆菌野生型BW25113(WT)相比,ydiB基因敲除菌株(△ydiB)仅对氨基糖苷类抗生素耐受,并且发现过表达菌株BW25113-PCA24N(ydiB)能恢复对庆大霉素的敏感性。因此,证明ydiB基因是氨基糖苷类抗生素作用的关键基因,有望成为氨基糖苷类抗生素作用的新靶点。

狐肺炎大肠杆菌yihe基因缺失株的构建及致病性

为研究YihE蛋白在狐肺炎大肠杆菌致病过程中的作用,利用λ-Red同源重组方法构建狐源大肠杆菌yihe基因缺失株,并从生长特性、生化特性、抗吞噬能力、菌株毒力等几方面对突变菌株进行评价。结果表明:与狐肺炎大肠杆菌野生型菌株相比,yihe基因缺失株生长特性和生化特性无明显差异,但其抗吞噬细胞吞噬能力以及胞内存活能力有明显下降,细菌半数致死量有显著提高。本试验成功构建狐肺炎大肠杆菌yihe基因缺失株,为研究YihE蛋白的作用机制奠定基础。